文档介绍:腺病毒(adenovirus)是一种没有包膜的直径为70~90 nm的颗粒,由252个壳粒呈廿面体排列构成。每个壳粒的直径为7~9 nm。衣壳里是线状双链DNA分子,约含35 000 bp,两端各有长约100 bp的反向重复序列。由于每条D特征的转基因动物的一个较好的系统。
6. 能在悬浮培养液中扩增
293细胞可以适应悬浮培养,这一调整可使病毒大量扩增。大量事实证明悬浮293细胞可在1~20L的生物反应器中表达重组蛋白。
7. 能同时表达多个基因
这是第一个可以在同一细胞株或组织中用来设计表达多个基因的表达系统。最简单的方法是将含有两个基因的双表达盒插入腺病毒转移载体中,或者用不同的重组病毒共转染目
的细胞株来分别表达一个蛋白。测定不同重组病毒的MOI比值可正确估计各重组蛋白的相对共表达情况。
正是由于具有以上一些优点,腺病毒被极其广泛地应用于体外基因转导、体内接种疫苗、和基因治疗等各个领域。
分类及致病性
分类及自上个世纪50年代发现并成功分离腺病毒以来,已陆续发现了100余个血清型,其中人腺病毒有47种,分为A、B、C、D、E和F六个亚群(subgroup)。基因治疗常用的人的2型及5型腺病毒在血清学分类上均属C亚群,在DNA序列上有95%的同源性。二者的增殖能力非常强,滴度通常可以达到109pfu (plaque forming unit)/ml,其在单个细胞中的基因组拷贝数可达104(约占细胞总DNA的10%)。病毒颗粒比较稳定,通过CsCl梯度离心可以达到1010~1011pfu/ml,满足动物实验的要求。
2型和5型腺病毒的致病性主要表现为可以导致儿童上呼吸道感染。在感染的最初几天,由于病毒大量复制和释放,会出现中度发热、浑身酸痛、乏力、咽痛等症状。但这些症状通常是比较短暂而轻微的,在以后的几天里,会随着中和抗体的产生而逐渐消失。虽然可以说高滴度和高免疫原性是腺病毒的主要特点,但也是相对的,如8型腺病毒(主要感染小肠和结膜组织)可以在扁桃体等淋巴组织中潜伏下来。在C亚群的其他一些腺病毒中也可以见到同样的现象,这是因为病毒的E3区编码的功能可使其逃避宿主的免疫打击。这似乎有助于理解为何腺病毒载体在造血系细胞中的基因转导效率明显低于其他组织、细胞。
腺病毒的生活周期
腺病毒的生活周期可以分为两个截然不同却又不能割裂开来的两个阶段。第一阶段包括腺病毒颗粒粘附和进入宿主细胞,将基因组释放到宿主细胞核中,以及有选择性地转录和翻译早期基因。在这个阶段,细胞为病毒基因组复制和腺病毒晚期基因表达并最终释放成熟的感染颗粒,即第二阶段,作好了准备。第一阶段将在6~8个小时内完成,第二阶段则更快,只需4~6个小时。
粘附和进入细胞
腺病毒感染细胞的过程是从腺病毒纤毛的头节区粘附到细胞表面的特异性受体开始的。因为人腺病毒主要与柯萨奇B病毒共用一种受体,因此这种受体被称为柯萨奇/腺病毒受体即CAR(coxsackie/adenovirus receptor)。接下来病毒纤毛基底部五邻体表面的三肽RGD与细胞表面的αvβ3和αvβ5整合素结合,通过内吞作用将腺病毒内化到细胞中并进入溶酶体。在溶酶体的酸性环境下,腺病毒衣壳的构象将发生变化,被从溶酶体中释放出来,躲过溶媒体的消化作用。最后,腺病毒颗粒转位到细胞核,通过核孔将病