文档介绍：实验细胞器分离
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[目的要求]
(1)初步掌握细胞器的分离原理及一般方法。
(2)学****并掌握高速离心机和匀浆器的使用方法

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[实验原理]实验细胞器分离
第一页，课件共11页
[目的要求]
(1)初步掌握细胞器的分离原理及一般方法。
(2)学****并掌握高速离心机和匀浆器的使用方法

第二页，课件共11页
[实验原理]
细胞器的分离常通过组织细胞匀浆、分级分离和分析三个步骤完成。
分级分离方法有两种，即：差速离心法和密度梯度离心法。
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差速离心：
采取逐渐提高离心速度的方法分离大小不同的细胞器。被分离的分子越小，需要的离心速度越高。
大颗粒首先沉到管底
较小颗粒沉降
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速度区带分离法：
预先装入有一定密度梯度的材料（蔗糖或甘油），利用各种颗粒在梯度液中的沉降速度不同，使具有相同沉降速度的颗粒处于同一梯度层内。
注：待分离颗粒密度比介质密度都要大：
不能离心太久，否则两种颗粒都会沉到底部
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[内容与方法]
内容：
大鼠肝细胞细胞核及线粒体的分离
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方法：
(3) 过滤：
将组织匀浆完毕，用尼龙网过滤，每组取2ml的过滤液移入离心管中。
(2)匀浆:
每组取适量剪碎组织，放入匀浆器中,。
(1)取材：
将饥饿24h的大白鼠处死。迅速取出肝组织浸入预冷的生理盐水，洗去血污，滤纸吸干。在小烧杯中剪碎，。
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(4)离心：
第一次: 1000rpm,8min。
(5)纯化：
- Mg(Ac)2至2ml，混悬。用长针头注射器在混悬液下轻轻加入2ml - Mg(Ac)2溶液。尽量使两种溶液明显分层。 2000rpm离心15min。
，混匀
第二次: 1300rpm,8min。弃上清

重复一次
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（7）镜检：观察先用低倍镜。再用高倍镜
(6)细胞核鉴定：

。
涂片,空气干燥．
浸入95％的乙醇溶液5min，晾干
滴加***绿-派洛宁染液染色12min
分色:快速放入***中，记时90秒,用吸管吸水冲洗，擦干水分
固定：
染色：
悬浮：
在离心后的沉淀中加入几滴PBS，混匀
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线粒体的分离
将分离细胞核时收集的上清液以11400离心10分钟,弃去上清,,11400g离心10min,去上清。
鉴定:在干净的载玻片中央,-詹母绿染液染色15 min,盖上盖玻片,.
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[思考题]
本次实验中用了哪些离心方法，原理是什么？
1、染色时间要充分。
2、***分色时要迅速，以防细胞核脱色。
注意事项
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