文档介绍：葡萄糖酸发酵生产
葡萄糖酸的性质
葡萄糖酸是葡萄糖衍生的糖酸,分C6H12O7。为结晶状化合物，熔点131℃,呈弱酸性，溶于水，微溶于乙醇。在水溶液中转化为γ-葡萄糖酸内酯和 δ－葡萄糖酸内酯的平衡混合物。
葡萄糖酸作为蓬下每克菌体每分钟产生1umol氢醌的酶量。
蓝圈法的原理是微生物产生的葡萄糖氧化酶将培养基中的葡萄糖转化为葡萄糖酸，葡萄糖酸与KI反响将I- 离子复原为I元素，I与培养基中的可溶性淀粉反响形成蓝色化合物而使菌落周围出现蓝色圈，蓝色圈的大小与葡萄糖氧化酶的产量成正相关。该方法可以作为葡萄糖氧化酶产生菌的高通量筛选方法，大大提高葡萄糖氧化酶产生菌的诱变育种效率。
葡萄糖氧化酶产生菌的诱变选育黑曲霉P-9 经过紫外线照射处理，共获得8 个耐受2-脱氧-D-葡萄糖的突变菌株，分别是U-15、U-17 、U-56、U-69、U-78。5个耐2- 脱氧-D- 葡萄糖突变株经蓝圈筛选和发酵测定，有3个菌株的葡萄糖氧化酶产量高于出发菌株，产酶水平最高的是U-69 菌株，-9倍，结果见表1。
表1 经过紫外线诱变所获得的突变菌株的葡萄糖氧化酶活性
葡萄糖酸发酵生产
一材料和仪器
1 菌种黑曲霉〔U-69 菌株〕
2 培养基
(1) 查氏培养基( g ·L - 1 ) : 蔗糖30 ,NaNO3 4 g,
MgSO4 ·7H2O ,KCl ; FeSO4 g,K2 HPO4 1 g,
琼脂20 g,p H ,温度31 ℃。
(2) 种子培养基(g ·L - 1 ) :葡萄糖(水解糖) 40 ,麸
皮32 , ( N H4 ) 2 HPO4 g, KH2 PO4 g, MgSO4 · 7H2O ,CaCO3 10 g,p H 。
(3) 发酵培养基(g ·L - 1 ) :葡萄糖(水解糖) 100～ 300 , ( N H4 ) 2 HPO4 014 , KH2 PO4 012 , MgSO4 ·7H2O g,CaCO3 27～81 ,p H 。
主要仪器
SHZ-82 型恒温振荡器 SKP-201B 型电热恒温箱 SBA-240C 型生物传感分析仪 FLC-23 型超净工作台
722S 型可见分光光度计 TD52-2 型自动平衡离心机
10 L 发酵罐
培养方法
种子培养
250 mL 三角瓶中装液量为30 mL ,接种后置于
30 ℃、220 r ·min - 1摇床培养18～20 h 。
摇瓶发酵培养
取孢子悬液接入发酵培养基中(250 mL 三角瓶中
装液量为30 mL) 置于33 ℃、250 r ·min - 1 摇床培养,发酵结束后测残糖及葡萄糖酸的浓度。
发酵罐发酵
10 L 发酵罐装料7 L ,接种10 %的黑曲霉种子悬
液,搅拌转速250 r ·min - 1 ,无菌空气流量 ·h - 1 ,维持温度33 ℃,流加30 % 。残糖含量降至015 %以下时,结束发酵。
发酵过程影响葡萄糖酸产量的因素
葡萄糖浓度
发酵液PH值
溶氧
接种量
葡萄糖酸浓度的测定
发酵过程中葡萄糖酸的生成会导致发酵液p H 值下降,利用NaOH 与葡萄糖酸中来维持发酵p H 值时,生成葡萄糖酸的钠盐,其葡萄糖酸根可与Cu2 + 、Fe3 + 等金属离子发生络合反响,加热后呈现一定的色,660 nm 波长下可测定其吸收值,由标准曲线方程推算可知葡萄糖酸的浓度。
EDTA 定钙法，发酵过程中葡萄糖酸的生成导
致发酵液p H 值下降,利用Ca (O H) 2 及CaCO3 与葡萄糖酸中和来维持发酵p H 值时,生成葡萄糖酸的钙盐,通过直接测定发酵液中钙离子的含量可折算得到生成的葡萄糖酸浓度(W G) 。
cE ×V E ×M
W G = ——-————
V S