文档介绍：...wd...
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生物5’→3’DNA外切酶活性
T4噬菌体DNA聚合酶：不具备5’→3’DNA外切酶活性。外切酶活性比Klenow酶强200倍，对单链DNA作用强于双链DNA
T7噬菌体DNA聚合酶：不具备5’→3’DNA外切酶活性
Taq DNA聚合酶
反转录酶：催化以RNA或DNA为模板，合成DNA；具有RNA H酶的活性
末端脱氧核苷酸转移酶：催化dNTP沿5’→3’聚合，逐个加于线性DNA分子的3’末端；不需要模板
载体：(vector)来源于质粒、噬菌体或病毒的DNA分子，可供插入或克隆目的基因或DNA，并具有运载外源DNA导入宿主细胞的能力。
质粒载体：共价闭合环状DNA(cccDNA)；开环DNA(ocDNA)；线状DNA(lDNA)
质粒的三个重要性质：遗传传递的能力；遗传交换的能力；不相容性
用于克隆的质粒的三个要素：复制子、选择标记、多克隆位点
常用质粒载体：克隆载体、表达载体、突变载体、报告载体
λ噬菌体载体：插入型载体、置换载体
来源于噬菌体DNA，因可以插入较大DNA片段，常用于构建基因组文库和cDNA文库。
目的基因的常用制备方法
化学合成法：前提：基因的DNA的序列。小于100bp的片段：直接合成，最常用固相亚磷酸三酯法。 大片段目的基因：小片段粘接法、大片段酶促法
PCR法：前提：待扩增目的基因或DNA片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反响必需的双引物。
基因文库法：鸟枪法：适用于原核细菌目的基因的克隆别离
cDNA文库法(与mRNA互补的DNA)并非所有的mRNA分子都具有polyA构造；仅限于克隆蛋白质编码基因；mRNA含量少且t1/2短，对酶和碱极为敏感，别离纯化困难
第一链：mRNA模板，引物 (polyT) ，逆转录酶，dNTPs
第二链：自身引导法：取得的双链cDNA5’端会有几对碱基缺失(NaOH，煮沸；Klenow酶，dNTPs；S1内切酶)
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引导合成法：获得的cDNA能保持完整的5’端序列(TdT, Dctp；NaOH；退火；Klenow酶，dNTPs)
基因文库的完备性：指在构建的基因文库中任一基因存在的概率，它与基因文库最低所含克隆数N之间的关系可用下式表示：N= ln(1–P) /ln(1–f)，P=完备性，f=克隆片段的平均大小/生物基因组的大小
双酶切产生的粘性末端，最常用，可以确保连接方向的正确性
影响连接效率的因素：连接方式；目的基因与载体的浓度比例摩尔数比大于1；连接温度、时间、酶的活性、反响缓冲体系
重组DNA导入宿主细胞
导入大肠杆菌：CaCl2法；转染法
导入酵母：电转化法；化学转化法；原生质转化法
导入链霉菌：原生质转化法；电穿孔法
重组DNA导入哺乳动物细胞：显微注射法；DEAE葡聚糖转染法；DNA-磷酸钙转染法；阳性脂质体介导法；电穿孔法；细胞融合法；病毒感染法
重组子的筛选与鉴定
遗传标记筛选法：抗生素抗性筛选法；α互补筛选法(蓝白斑筛选——载体含有LacZα基因，X-gal培养基，成功导入的菌落显示为蓝斑)；营养缺陷型筛选法；噬菌斑筛选法
核酸分子杂交法：菌落原位杂交法；DNA印迹法；RNA印迹法
限制性内切酶图谱法：琼脂糖凝胶电泳鉴定各片段分子量，含有目的基因的为阳性克隆
DNA序列测定法
目的基因表达产物测定法
原核细胞表达的特点及选择
大肠杆菌(首选,遗传背景研究清楚；适合大规模生产(本钱低，周期短，效率高，操作简单)、芽孢杆菌、链霉菌等
缺点：缺乏翻译后修饰系统；容易以包涵体形式存在；外源蛋白容易被宿主酶系统水解
★外源基因表达的调控原件：复制子、启动子(表达效率的关键因素)和终止子、核糖体结合位点(即SD序列及SD序列到起始密码子AUG的距离)、识别翻译后修饰信号
用于原核表达的载体必须具备的条件：具有复制子、灵活的克隆位点和方便的选择标记、很强的启动子
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