文档介绍：转录组ref流程工作手册
一、Reference 流程生物学原理
实验流程
图一：转录组实验流程
当我们得到样品时，必须对其测序，才能得到分析所需的数据。测序根本过程：提取样品总RNA后，用带有Oligo(dT)的磁珠富数与基因编码区所有碱基数的比值。
4 Reads 在参考基因组上的分布
该分析主要是以图形方式概括给出Reads在基因组各个位置的分布情况，以及该位置基因的分布情况。

高级生物信息分析包含以下结果：
1 对基因结构进行优化
通过比拟测序结果和现有基因注释结果，对基因的 5'端或3'端进行延长。如图三所示，首先，将reads比对到基因组，提取基因组中被unique mapping reads覆盖的次数大于或等于某阈值〔默认为2〕且位置连续的区域作为转录活性区(Transcription Active Region, TAR，图中蓝色方块区域)；然后通过paired-end reads〔图中紫色线条〕将不同的TAR连接形成潜在的gene model；最后，通过比拟潜在gene model与现有基因注释的差异，对基因的5'端和3'端进行延长〔图中表现的仅是基因3’端发生延长的情况〕。
图三：基因结构优化
2 鉴定基因的可变剪切
可变剪切使一个基因产生多个mRNA转录本，不同mRNA可能翻译成不同蛋白。因此，通过可变剪切一个基因可能产生多个蛋白，极大地增加了蛋白多样性{Black, 2003 #6}{Stamm, 2005 #21;Lareau, 2004 #22}。虽然可变剪切在真核生物中普遍存在，但我们可能仍低估了可变剪切的比例，最近，基于高通量测序的可变剪切研究在人{Pan, 2021 #3} {Wang, 2021 #4} {Sultan, 2021 #5}
、小鼠{Tang, 2021 #18;Mortazavi, 2021 #19}、拟南芥{Filichkin, #156}中发现了很多新的可变剪切事件。
在生物体内，主要存在7种可变剪切类型：A〕Exon skipping; B〕Intron retention; C) Alternative 5’ splice site; D) Alternative 3’ splice site; E) Alternative first exon; F) Alternative last exon; G) Mutually exclusive exon. 下列图是我们利用高通量测序数据鉴别出来的7种可变剪切。(Reads数)。
图四：可变剪切示意图
A) Exon Skipping. 基因AK070385发生可变剪切形成两种不同的转录本，第1种转录本比第2种转录组本多一个外显子(exon), 我们将这种外显子称为inclusive exon, inclusive exon两侧的两个外显子称为 constitutive exon。B) Intron retention. 基因AK072590发生可变剪切形成两种不同的转录本，第2种转录本由retained Intron 与两侧的外显子一起形成新的外显子。C) Alternative 5’ splice site. 基因AK067602发生可变剪切形成两种不同的转录本，它们的3’端剪切位点一致但5’ 端剪切位点不同。D) Alternative 3’ splice site. 基因AK067602发生可变剪切形成两种不同的转录本，它们的5’端剪切位点一致但3’ 端剪切位点不同。E) Alternative First Exon. 基因AK068497发生可变剪切形成两种不同的转录本，它们的不同之处在于第一个外显子不同。F) Alternative Last Exon. 基因AK064908发生可变剪切形成两种不同的转录本，它们的不同之处在于最后一个外显子不同。G) Mutually Exclusive Exon. 基因AK101575发生可变剪切形成两种不同的转录本，两转录本之间相同的外显子称为
constitutive exon，不同的外显子称为inclusive exon，两个inclusive exon不能同时存在与同一转录本中，只能分别存在于不同转录本中。
下面，概述检测可变剪切的算法。首先，我们使用软件“tophat〞 {Trapnell, 2021 #1}鉴定转录本的剪切位点 (junction site)〔使用软件默认参数〕，剪切位点给出了转录本不同外显子的边界及组合关系，如图五，我们检测到三个剪切位点，分别说明Exon1和Exon2连接在一起，Exon