文档介绍：精选优质文档-----倾情为你奉上
精选优质文档-----倾情为你奉上
专心---专注---专业
专心---专注---专业
精选优质文档-----倾情为你奉上
专心---专注---专业
双荧光报告基因精选优质文档-----倾情为你奉上
精选优质文档-----倾情为你奉上
专心---专注---专业
专心---专注---专业
精选优质文档-----倾情为你奉上
专心---专注---专业
双荧光报告基因分析
实验目的：
研究转录因子的活性和调控元件的活性。
实验原理：
通过将感兴趣的目的基因转录调控元件构建到带荧光素酶（firefly luciferase）的表达载体，如pGL3，构建成报告基因质粒，使这段DNA序列调控luciferase的转录。然后将报告基因质粒转染细胞，适当刺激或处理后裂解细胞，并加入底物荧光素后（luciferin），luciferase可以催化荧光素发出荧光，从而可以通过测量荧光值的高低判断刺激前后或不同刺激对感兴趣的调控元件的影响。为避免由于质粒转细胞时效率的差异而带来的误差，可以同时转入Renilla荧光素酶的报告基因质粒作为内参，即双荧光报告系统。该实验可以用于研究转录因子对promoter或enhancer序列的调控，也可以用于研究受体活性，细胞内信号通路，或者microRNA对基因表达的调控。
实验过程：
质粒构建
常用的载体有pGL3系列，包括pGL3-basic(附图1a)，pGL3-promoter(附图1b)，pGL3-enhancer(附图1c)。如果要研究的序列是promoter，可选择将目的片段插入pGL3-enhancer载体；若要研究的序列是enhancer，则可选择pGL-promoter载体。
，并以基因组DNA为模板PCR，克隆目的片段，通过合适的酶切，插入载体，构建报告基因表达质粒。
2．转染
将报告基因质粒和作为内参的Renilla以及待研究的转录因子的表达质粒共转染细胞，并根据需要刺激或处理细胞，24h-48h后收细胞。在共转染时，由于内参质粒
精选优质文档-----倾情为你奉上
精选优质文档-----倾情为你奉上
专心---专注---专业
专心---专注---专业
精选优质文档-----倾情为你奉上
专心---专注---专业
Renilla有很强的promoter/enhancer，因此报告基因质粒:Renilla转染量一般为10：1到50：1。
3．Luciferase活性的测定（以promega的双荧光报告试剂盒为例）
细胞裂解
试剂盒中提供的裂解液为5X PLB（passive lysis buffer），使用前取1体积的PLB，加4体积的dH2O混匀。去掉细胞培养液，用PBS洗一遍以去掉残留的培液，加入1X PLB。并将培养板于摇床上室温摇15min，使细胞充分裂解。将细胞裂解液转移至ep管，12000g X 30sX 4℃离心。上清中即含有firefly luciferas 和Renilla luciferase，用于测定酶活性；而沉淀为核蛋白，可用于western blot检测转录因子的表达