文档介绍：关于免疫荧光细胞化学技术 (3)
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免疫荧光细胞化学技术
(immunofluorescence cytochemistry)
采用荧光素标记的已知抗体或抗原作为探针，检测待测细
最大发射光谱:620nm
(4) 4-乙酰***-4-异硫***酸-2-硫酸芪（SITS）---蓝色荧光
(5) 得克萨斯红（Texas red）
(6) 藻红素R
(7) 花青（Cyanine,Cy2,Cy3,Cy5）…
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四、荧光抗体的质量控制 主要进行特异性和敏感性两个方面的鉴定。 1 特异性染色效价测定--与相应抗原标本染色
2 非特异性染色测定--与相类似抗原标本染色
3 吸收试验---在荧光抗体中加入过量抗原，吸收后再用相应抗原
标本染色，结果无明显阳性荧光。
4 F/P比值的测定方法
F（荧光素）和P（抗体蛋白）的克分子比值反映荧光抗体的特异性染色质量， F/P=1-2，
过高------非特异染色增强；
过低------荧光很弱，降低敏感性。
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荧光抗体的保存
0-4℃或-20℃低温保存，防止抗体活性降低和蛋白变性；
小量分装；
真空干燥后更易长期保存。
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五、荧光抗体染色方法
适用标本：涂片、印片、细胞单层培养物或组织切片，经适当固定或不固定；
方法：直接法、间接法
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阴性对照：采用正常血清染色，结果为阴性。
1 直接法
（1）基本原理 用已知特异性抗体与荧光素结合，制成荧光特异性抗体，直接与细胞或组织中相应抗原结合，在荧光显微镜下即可见抗原存在部位呈现特异性荧光。
特点：适合做细菌、螺旋体、原虫、真菌及浓度较高的蛋白质抗原如肾、皮肤的检查和研究。但一种荧光抗体只能检查一种抗原，敏感性较低
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2 间接法
（1）基本原理 先用未标记特异性抗原与细胞或组织内抗体反应，再用此抗原的特异性荧光抗体与结合在细胞内抗体上的抗原相结合，抗原夹在细胞抗体与荧光抗体之间，故称夹心法。
优点：只需制备一种荧光抗体可检出多种抗原，敏感性较高，能解决一些不易制备动物免疫血清的病原体（麻疹）等的研究和检查，广泛应用于自身抗体和感染病人血清的检验。
缺点：非特异性着色机会较多，染色时间长。
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阴性对照：用正常血清代替一抗，其余步骤同上。
结果
荧光处即阳性细胞分布部位。
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4 双重免疫荧光染色法
适用：在同一细胞组织标本上需要同时显示两种抗原。
方法：如A抗原的抗体--- FITC 标记，
B抗原的抗体--- RB200标记。
(1)一步双染法
将两种标记抗体按适当比例混合（A+B)；
直接法进行染色反应。
(2)二步双染法
先用RB200标记的B抗体,不必洗去；
再用FITC标记的A抗体染色；
按间接法进行。
结果： A抗原呈黄绿色荧光； B抗原呈桔红色荧光。
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5 膜抗原荧光抗体染色方法
原理和步骤：直接法或间接法；
适用：可对活细胞在试管内进行染色，常用于T和B细胞、细胞培养物、瘤细胞抗原、受体等。
结果：阳性荧光主要在细胞膜上。
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六、荧光显微镜检查方法 1 荧光显微镜
超高压光源、滤板系统(包括激发和压制滤板)、光学系统和摄影系统等主要部件组成，是利用一定波长的光激发标本发射荧光。
（1）光源
光源的亮度应根据荧光素的类型选择。小功率***灯可满足激励一般荧光染料的要求。
（2）滤板系统：包括激发滤片，阻断滤片、隔热滤片，分光镜和其他中性滤片。是荧光显微镜的重要组成部分，是获得特定波长光，清晰的荧光影像和发挥显微镜最佳性能之关键。了解滤片性能，正确地选择滤片是观察荧光效应的前提和必要条件。
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荧光显微镜的滤片系统
激励法