文档介绍：关于大肠杆菌感受态细胞
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1. 实验目的和要求
通过本实验学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞和外源质粒DNA转入受体菌细胞的技术以及筛选转化体的技术。了解细胞转化的概念及其在分子生物学研究中的意义。
第个LacZ基因的调控序列和头146个氨基酸的编码信息，编码-互补肽，该肽段能与宿主编码的缺陷型-半乳糖苷酶实现基因内互补（ -互补）。当这种载体转入可编码－半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞中时，在异丙基--D硫代半乳糖苷（IPTG）的诱导下，宿主可同时合成这两种肽段，虽然它们各自都没有酶活性，但它们可以融为一体形成具有酶活性的蛋白质。所以称这种现象为-互补现象。
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由互补产生的－半乳糖苷酶(LacZ)能够作用于生色底物5－溴－4－氯－3－吲哚－－D－半乳糖苷(X-gal)而产生蓝色的菌落，所以利用这个特点，在载体的该基因编码序列之间人工放入一个多克隆位点，当插入一个外源DNA片段时，会造成LacZ()基因的失活，破坏-互补作用，就不能产生具有活性的酶。所以，有重组质粒的菌落为白色，而没有重组质粒的菌落为蓝色。
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重组DNA转化细菌过程示意图
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3．仪器、材料和试剂
无菌超净台，电热恒温水浴，分光光度计，离心机，移液器，微型离心管等；
菌株： DH5α
质粒：pBluscript KS+DNA 片段的重组质粒以及pBluscript KS 空质粒；
LB培养基；含抗菌素的LB平板培养基（氨苄青霉素，浓度50-100µg／mL，X-gal 20-48µg/ml, IPTG 100 µg/ml。一般将抗生素、X-gal和IPTG配制成1000储备液，用时按培养基的量再加入）；
预冷CaCl2溶液（／L）
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4．操作步骤
1）大肠杆菌感受态细胞的制备(CaCl2法)
（1） DH5α菌平板上挑取一单菌落，接种于3～5ml LB液体培养中，37℃振荡培养12h左右，直至对数生长期。将该菌悬液以1:100～1:50转接于100ml LB液体培养基中，37℃振荡扩大培养，当培养液开始出现混浊后，每隔20～30min测一次OD600nm，至OD600nm≤；
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（2）每组取培养液3个2ml转入2ml离心管中，在冰上冷却20-30min，于4℃，4000r／min离心10min（从这一步开始，所有操作均在冰上进行，速度尽量快而稳）；
（3）倒净上清培养液，／L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰浴；
（4）0～4℃，4000r／min离心10min；
（5）弃去上清液，加入500µ／L CaCl2溶液，小心悬浮细胞。0～4℃，4000r／min离心10min；
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（6）弃去上清液，加入100µ／L CaCl2溶液，小心悬浮细胞，冰上放置片刻后，即制成了感受态细胞悬液；
（7）制备好的感受态细胞悬液可直接用于转化实验，也可加入占总体积15％左右高压灭菌过的甘油，，置于-70℃条件下，可保存半年至一年。
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2）细胞转化
(1) 分别取3个100µl感受态细胞悬液(如是冷冻保存液，则需化冻后马上进行下面的操作)，第一组，加入10 µl重组质粒DNA(体积不超过10µl)+ 100µl感受态细胞，此管为转化实验组。第二组，插入DNA片段对照组，即酶切后DNA片段25ng+100µl感受态细胞悬液；第三组，质粒DNA对照组，即1ng 未酶切pBluescript 质粒DNA十100µl感受态细胞悬液。
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(2) 将以上各样品轻轻摇匀，冰上放置20-30min，于42℃水浴中保温1－2min，然后迅速冰上冷却2min
(3) LB液体培养基（不需在冰上操作），，该溶液称为转化反应原液，摇匀后于37℃振荡培养约45-60min ，使受体菌恢复正常生长状态，并使转化体表达抗生素基因产物(Ampr)。
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3) 平板培养（有时需要稀释）
，分别接种于含抗菌素LB平板培养基上，涂匀（如果用玻璃棒涂抹，酒精灯烧过后稍微凉一下再用，不要过烫）。
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(2) 菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿，于37℃恒温培养箱内培养过夜(12-16小时)，待菌落生长良好而又未