文档介绍：关于蛋白质的共价结构 (3)
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一、蛋白质的分子大小
单体蛋白质：有的蛋白质是由一条多肽链组成，如溶菌酶、肌红蛋白
寡聚蛋白质：血红蛋白（α2、β2）、己糖激酶（α4）
不含辅基的。
N－端
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(2)多肽链的拆分
由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分。
有些寡聚蛋白质，多肽链靠非共价键连接的；
用变性剂：8mol/L
尿素或6mol/L盐
酸胍处理，
→SDS-PAGE。
有些多肽链间是通过
二硫键交联的
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(3)断开多肽链内的二硫桥
几条多肽链通过二硫键交联在一起，如下方法断开：
可在8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下：
用过量的-巯基乙醇（还原剂）处理，使二硫键还原为巯基。
过甲酸氧化： —S—S— + HCOOOH → －SO3H
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(4)分析每条多肽链的氨基酸组成
分离、纯化的部分
多肽链样品完全水解
（酸、碱）后 ，测
定其氨基酸组成，并
计算出氨基酸成分的
分子比或各种残基的
数目，便于选择裂解
方法及试剂。
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(5)鉴定多肽链的N－末端和C－末端残基
多肽链端基氨基酸分为两类：N-端氨基酸和C-端氨基酸。
在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。
N－末端
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Sanger法：2,4-二硝基***苯（Sanger试剂）在碱性条件下，能够与肽链N-端的游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP）。
在酸性条件下水解，得到黄色DNP-氨基酸。该产物能够用***抽提分离。不同的DNP-氨基酸可以用层析法、色谱法进行鉴定。
N-末端氨基酸测定
二硝基***苯（DNFB或FDNB）法
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在碱性条件下，丹磺酰***（二甲氨基萘磺酰***）可以与N-端氨基发生酰基化作用，得到丹磺酰-氨基酸,水解氨基酸不需提取直接电泳或薄层层析加以鉴定。
此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到110-9mol，比DNFB法高100倍。
丹磺酰***（DNS）法
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Edman法：多肽或蛋白质的末端氨基酸与苯异硫***酸酯（ PITC ,Edman 试剂）作用，生成无色PTH－氨基酸，有机溶剂抽提，层析、色谱法鉴定。
PTC基的引入只是降低第一个肽键的稳定性，可测定氨基酸序列。
③ 苯异硫***酸酯（PITC）法
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氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的N-端逐个的向里水解。
反应时间→氨基酸种类和数量→动力学曲线，N-末端残基顺序。
酶对各种肽键的敏感性不一样。
氨肽酶法
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多肽与无水肼加热，C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸→氨基酸酰肼化物。苯甲醛沉淀氨基酸的酰肼，上清中的C端游离氨基酸借助FDNB或DNS法、层析鉴定。
Gln、Asn、Cys、Arg不能用此法。
① 肼解法
C-末端氨基酸测定
无水
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羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的C-端逐个的水解。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的C-末端残基顺序。
②羧肽酶法
羧肽酶A：除Pro、Arg、Lys
羧肽酶B：只水解Arg、Lys
目前常用的羧肽酶有四种：A,B,C和Y；A和B来自胰脏；C来
自柑桔叶；Y来自面包酵母。
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(6)裂解多肽链成较小片段
采用不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，对每段肽分离纯化、氨基酸鉴定。
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较高专一性，水解产率高，所以使用广泛。常见的蛋白酶（内切酶）有：
胰蛋白酶： Lys （Arg） ——X
胰凝乳蛋白酶（糜蛋白酶）Tyr（ Trp 、 Phe ）——X
胃蛋白酶：Phe(Trp、 Try、 Leu)——Phe(Trp、 Try、 Leu)
葡萄球菌蛋白酶（Glu蛋白酶）： Glu——X
梭菌蛋白酶（Arg蛋白酶）： Arg——X
多肽链的选择性降解
①酶裂解法
C
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溴化***水解法， —Met—X—
羟***（NH2OH）断裂， —Asn—Gly— 专一性不强
②化学裂解法
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(7)测定各肽段的氨基酸序列
最常用的肽段测序方法是Edman化学降解法，此外还有酶解法、质谱法。
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