文档介绍：实验一质粒DNA的提取和鉴定
质粒DNA的提取方法
碱裂解法；
煮沸裂解法；
酚氯仿抽提法；
概括起来主要是用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理。
基本思路
培养细菌使质粒扩增；
收集和裂解细12000g离心10分钟。
7、将水相（400uL）移入干净eppendorf管中，加入等体积酚/氯仿，颠倒混匀，12000rpm离心10min。
8、将水相（350uL）移入干净eppendorf管中，加入2倍体积的无水乙醇，振荡混匀后置于-20℃冰箱中20分钟，然后4℃下12000g离心10分钟。
9、弃上清，将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出， 70％乙醇洗沉淀一次，4℃下12000g离心5-10分钟。
10、吸除上清液，将管倒置于卫生纸上使液体流尽，真空干燥10分钟或室温干燥。
11、将沉淀溶于10μl TE缓冲液（，含20μg/ml RNaseA）中，储于-20℃冰箱中。
LB液体培养基（Luria-Bertani）
称取蛋白胨（Tryptone）10g，酵母提取物（Yeastextract）5g，NaCl10g，溶于800ml去离子水中，，加去离子水至总体积1升，高压下蒸气灭菌20分钟。
溶液I
50mmol/L葡萄糖，25mmol/ L T r i s. Cl（），10mmol/L EDTA（）。溶液Ⅰ可成批配制，每瓶100ml，高压灭菌15分钟，储存于4℃冰箱
溶液I：重悬细菌；
葡萄糖：比重大，使细菌不易沉淀；
Tris－HCl：缓冲体系；
EDTA：螯合金属离子；
溶液Ⅱ
NaOH（临用前用10mol/LNaOH母液稀释），1％SDS
溶液II——破膜，变性基因组DNA和蛋白质；
SDS——破膜作用，变性蛋白质；
NaOH——破膜，变性基因组DNA；
溶液Ⅲ
5mol/LKAc60ml，，H2O ，定容至100ml，并高压灭菌。溶液终浓度为：K+3mol/L，Acˉ5mol/L。
溶液III——中和溶液，复性质粒DNA；
酚/氯仿（1:1）
酚——变性蛋白质；
氯仿——萃取溶液中的酚；
分为两层，上层为水层，下层为酚氯仿混合液。吸取时不要震荡。
乙醇
无水乙醇（2倍体积）——沉淀质粒DNA；
70%乙醇——洗涤质粒DNA沉淀，除去沉淀中的盐分；
核酸的定量
260 nm， 1OD值相当于：
双链DNA浓度为50g/ml
单链DNA浓度为40g/ml
A260/A280 = （DNA）
A260/A280 = （RNA）
电 泳 Electrophoresis
一、定义
电泳—带电粒子在直流电场中向着电性相反电极移动的现象。
电泳分析技术—利用电泳现象进行物质分离的技术。
二、电泳分析技术发展概况
1809年 发现电泳现象
1937年 Tiselius 自由界面电泳
1948年 Wieland 滤纸电泳
1980年 毛细管电泳
(capiliary electrophoresis)
三、电泳分析技术的分类
分析电泳
制备电泳
常压电泳 0～500 V
高压电泳 500～3000V
自由电泳—不使用支持物，在溶液中进行。
区带电泳—使用支持物
4. 按支持物的物理性状不同
滤纸及其他纤维薄膜电泳，如醋酸纤维素、玻璃纤维、聚氯乙烯纤维
凝胶电泳，如琼脂、琼脂糖、硅胶、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶电泳
粉末电泳，纤维素粉、淀粉、玻璃粉电泳
丝状电泳，如尼龙丝、人造丝电泳
5. 按支持物的装置形式不同
平板式电泳
垂直板式电泳
垂直柱式电泳
连续pH电泳—指电泳过程中pH保持不变；
不连续pH电泳—指电极缓冲液和电泳支持物的不同区段也有不同的pH ；
电泳技术的特点:
凡是带电物质均可应用某一电泳技术进行分离,并可进行定性或定量分析;
样品用量极少;
设备简单;
可在常温进行;
操作简便省时;
分辨率高.
四、电泳的基本原理
一个分子，如能解离或能吸附带电质点，在电场中便会向正极或负极移动。
移动速度——以蛋白质分子为例:
F= EQ
（Q：有效电荷; E：电位梯度）
F’=6rv
（F’：摩擦阻力; v：在介质粘度η中半径为r的颗粒的