文档介绍：32
广东省高教厅重点实验室－现代生物技术实验室实验教材
基因工程技术实验指导
(研究生教材)
华南农业大学
现代生物技术实验室基因工程实验分室
二零零五年二月
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基因工程实验室学生守则
1. 实验课前必须预****实验指导，了解实验原理和基本操作过程。
2. 实验课不得无故缺席、迟到或早退。非课表规定的实验时间，应按任课老师的安排，准时来进行操作。
3. 实验课时，应自觉遵守课堂纪律，保持实验室的安静与清洁卫生，不得大声谈笑，不得抽烟、随地乱丢纸屑、吐痰等。
4. 实验前清点好仪器、用具与试剂，实验台面应随时保持整洁，仪器、药品摆放整齐。公用试剂用毕，应立即盖严放回原处。勿使试剂、药品洒在实验台面和地面上。
5. 实验中应严格遵守操作规程进行实验，细心观察实验现象，并如实记录实验结果。每个实验完成后，要写实验报告。
6. 实验完毕，应清洗好当天所用的器皿和用具，整理好仪器与实验台面，经任课教师同意方可离开。
7. 使用仪器、药品、试剂和各种其它物品需注意节约。洗涤和使用仪器时，应小心仔细，防止损坏仪器。
8. 废液可倒入水槽内，同时放水冲走，强酸、强碱等腐蚀性液体，应先用水稀释后，方可倒入水槽内，并放水冲走。废纸等其它固体废物，不得倒入水槽，应倒入废物桶内。
9. 严禁随意动用非当天实验所需使用的仪器和物品，使用仪器应严格按仪器使用的程序进行，贵重仪器需在任课老师的指导下进行操作。实验过程中如仪器出现故障，应及时向任课老师汇报情况，如违反使用规定造成的损坏，使用者将负责修理与赔偿。
10. 每次实验课由任课教师安排学生轮流值日，值日生负责当天实验室的卫生、安全和一切服务性的工作，最后关好水电、门窗，经任课教师检查同意后方可离开。
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实验一 碱裂解法抽提质粒DNA
一、目的
学****并掌握基因工程操作技术中最常用的载体质粒DNA的提取方法。
二、原理
质粒DNA的提取常用碱裂解法、煮沸法、SDS法、Triton-溶菌酶法等，其中以碱裂解法最为常用。本方法有质粒DNA产量高、快速等优点。其原理为: 在碱性溶液中，双链DNA氢键断裂，DNA双螺旋结构遭破坏而发生变性，但由于质粒DNA分子量相对较小，且呈环状超螺旋结构，即使在高碱性pH条件下，两条互补链也不会充分别离，当加入中和缓冲液调时，变性质粒DNA又恢复到原来的构型；而线性的大分子量细菌染色体DNA则不能复性，与细胞碎片、蛋白质、SDS等形成不溶性复合物。通过离心沉淀，细胞碎片、染色体DNA及大部分蛋白质等可被除去，而质粒DNA及小分子量的RNA则留在上清液中。混杂的RNA可用RNA酶(RNaseA)消除。再用酚/***仿处理，可去除残留蛋白质。
三、实验材料
含质粒pBluescript II的大肠杆菌DH10B。
四、仪器设备
高压灭菌锅 超净工作台 恒温摇床
台式离心机〔冷冻式或非冷冻式〕 旋涡振荡器
五、实验用具
培养用试管 量筒 冰盒
微量离心管 微量取液器 吸管头假设干
六、试剂(配制方法见附录)
LB培养基 氨苄青霉素(Amp, 100 mg/ml) 20% SDS
溶液I； 溶液II(最好现配现用)； 溶液III(-20℃预冷)
4 N NaOH 3 M NaAc() 无水乙醇
TE缓冲液(pH ) RNase A(10 mg/ml) 70%乙醇
饱和酚/***仿/异戊醇(25:24:1，注：在本实验指导的其它章节省略为“酚/***仿”，而“***仿”均指已加入了1/24体积的异戊醇)
七、实验步骤
细菌的培养
配制LB液体和琼脂培养基，并高压灭菌。
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在含Amp 100 mg/ml的琼脂培养基平板上(划线或涂抹)培养出单菌落(37℃，18~20小时)。
在培养管中加入含Amp 100