文档介绍：蛋白质相互作用及研究方法沈波基础医学院病原生物学系 ******@njmu. 025-86862793 * DNA * RNA * Protein Cell assembly and function/ 细胞组装与功能 Messenger Headquarter Executor Stable, DNA mutation Stable/Versatile, rRNA, tRNA, mRNA Versatile, Protein modification Protein-Protein interaction Protein-ponent interaction 已有超过 1000 个物种的基因组完成测序,大量的新基因不断被发现,然而单纯的基因组 DNA 序列尚不能解答许多生命问题。基因是相对静态的,而基因编码的产物—蛋白质则是动态的,具有时空性和调节性,是生物功能的主要体现者和执行者。蛋白质的表达水平、存在方式以及相互作用等直接与生物功能相关。?蛋白质序列特点和结构?蛋白质进化过程和保守序列?蛋白在细胞内的定位及其相关联的细胞器?蛋白质表达谱?蛋白质翻译后修饰情况?了解与其相关联的其他细胞蛋白质蛋白质信息的不同层次蛋白质之间的相互作用是细胞进行一切活动的基础。蛋白质之间相互作用以及通过相互作用而形成的蛋白复合物是细胞各种基本功能的主要完成者。几乎所有的重要生命活动,包括 DNA 的复制与转录、蛋白质的合成与分泌、信号转导和代谢等等,都离不开蛋白质之间的相互作用。蛋白质间相互作用研究的重要性 Human protein-protein interaction (PPI) network Towards a proteome-scale map of the human protein – protein work Rual, Vidal et al. Nature 437 , 1173-1178 (2005) 错误的蛋白质相互作用可能导致疾病如 Alzheimer ’s disease, beta- 淀粉样结构的堆积(alpha-synuclein 与synphilin-1 结合); Synphilin-1 associates with alpha-synuclein and promotes the formation of cytosolic inclusions. Nat . 1999;22(1):110-4 如尤文氏肉瘤融合蛋白( EWS-FLI1 )可黏附于另一个 RNA 解旋 A蛋白( RHA )控制基因转录。 A small molecule blocking oncogenic protein EWS-FLI1 interaction with RNA helicase A inhibits growth of Ewing's a. Nat Med. 2009;15(7):750-6. 蛋白质相互作用分析研究思路一、鉴定与某个感兴趣的蛋白质相互作用的所有可能的蛋白质。( 暂不考虑生理功能) 二、详细描述鉴定出蛋白的生物功能及相互作用对其功能的影响。( 研究尽可能接近胞内条件) 三、运用高通量方法鉴定调节这种作用的关键因子。等离子表面共振技术 SPR 免疫共沉淀 Co-PI Far Western blot 串联亲和层析 TAP 融合蛋白沉降技术 GST-Pull down In vitro 酵母双杂交 Yeast Two-hybrid 噬菌体展示 Phage display In vivo 荧光共振能量转移 FRET 蛋白质-蛋白质相互作用研究方法蛋白芯片 Protein Chip 细胞内共定位 Cellular colocalization Two-hybrid system 是 90年代初发展起来的新方法。在真核模式生物酵母中进行的,研究活细胞内蛋白质相互作用,对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能够通过报告基因的表达产物敏感地检测得到,它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。 haromyces cerevisiae 一、酵母双杂交系统 1989 Stanley Field ’s lab published the first report on Yeast Two-Hybrid assay. Fields S, Song O. A novel ic system to detect protein-protein interactions. Nature, 1989, 340(6230):245-246