文档介绍：实验八酵母核糖核酸的分离及组分鉴定、DNA的Tm值测定
实验九 DNA Tm值的测定
一、目的
正确理解DNA 的Tm值的定义及测定Tm值的意义；
掌握DNA Tm值的测定方法；
了解DNA变性、复性的机理与条件。
实验八酵母核糖核酸的分离及组分鉴定、DNA的Tm值测定
实验九 DNA Tm值的测定
一、目的
正确理解DNA 的Tm值的定义及测定Tm值的意义；
掌握DNA Tm值的测定方法；
了解DNA变性、复性的机理与条件。
二、原理
当DNA在稀盐溶液中加热到80-100℃时，双螺旋结构即发生解体，两链分开，形成无规则线团。与此同时发生了一系列理化性质的变化，其中260nm的消光值增高（增色效应）；粘度降低；浮力密度降低等。DNA的这些变化是属于爆发式的，变性作用发生在很窄的温度范围内。通常把DNA的双螺旋结构失去一半时的温度称为该DNA的熔点或熔解温度（melting temperature）,用Tm表示，DNA的Tm值一般在70-85℃之间。变性后的DNA在温度降低的过程中得以复性，A260nm值再次下降到接近自然状态的消光值。
DNA的Tm值的影响因素:
① DNA的均一性 均一性越高的样品，熔解的温度范围越窄；
② G-C含量 Tm值是随G-C含量增高而增高的。由Tm值可推算出G-C的含量。其经验公式为 （G-C）%=（Tm-）×；
③ 介质中离子强度 一般离子强度较低的介质中DNA熔解温度较低，熔解温度也较宽。
三、操作步骤
1、将8个恒温水浴箱，调节温度为50、60、70、75、80、85、90、95、100℃
2、 取12支有盖的大试管，各管加入3ml DNA溶液，盖上帽子，在各水浴箱中分别放一支，在100℃水浴锅中放三支，另有一支放在室温下，保温15min后迅速取出，并保持温度去测定各管（10管）DNA溶液的A260nm。以1×-,为对照液。
3、将在100℃保温15mon后的另两支装有DNA溶液的试管取出，分别放在50℃，再在260nm波长下测定消光值。
四、结果与分析
1、计算各温度下的A260nm（t） /A260nm（25℃），并以此比值对温度作图（见图十三），连接各点成平滑曲线，测定出消光值增加的中点，此即Tm。计算G-C%含量。
公式为：（G-C）%=（Tm-）×
2、测出在100℃处理后、置50℃（A260/50℃和A260室温），分析该两个数值是否存在差异性及产生差异性的原因。
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