文档介绍：研究生分子生物学实验讲义
实验一人外周血淋巴细胞总RNA的提取、电泳
一、实验目的
学****并掌握人外周血淋巴细胞总RNA的分离提取及琼脂糖凝胶电泳检测方法。
二、实验原理
细胞的总RNn空气干燥（勿完全干躁，难再溶），加入20ul的DEPC水溶
解沉淀
注意：异硫***酸胍是很强的蛋白变性剂，但它不能使RNA酶发生不可逆失活。因此，假如去蛋白后，样本被残余的RNA酶污染，这些酶会在变性剂去除后，重新恢复活性。因此，将水相中RNA彻底从有机相中分离出，并避免通过脏的容器和手套重新被蛋白污染，这点很重要。
3、琼脂糖凝胶电泳检测
1）、3%过氧化氢浸泡电泳槽、胶板、梳子30分钟以上后，以DEPC处理的水冲洗，备用；
2）、以DEPC处理的水稀释50хTAE（DEPC处理的水配制，高压灭菌）为1хTAE
备用；
3）、用以上1хTAE配制1%琼脂糖凝胶电泳胶；
4）、电泳5V/cm 电泳20min
5）、电泳完毕后，在凝胶成像系统上照相分析，电泳图谱：28s和18 s条带清晰、28s亮度是18s亮度的2倍以上
实验二反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）扩增CCL-17基因
一、实验目的
通过本实验掌握RT-PCR工作原理及操作方法。
二、实验原理
逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR) 是间接对某一特定的RNA分子的扩增，可分作相对独立的两个步骤：即RT（将mRNA反转录成cDNA）和PCR（通过聚合酶链式反应扩增特定的cDNA）。其原理是：由总RNA或poly(A)+RNA(mRNA) 采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA，再以此cDNA为模板以特定的寡核苷酸作引物进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因。
本实验通过RT-PCR法扩增的基因为人趋化因子17基因，即CCL-17，该基因编码的CCL-17蛋白是一种由人淋巴细胞分泌的细胞因子，具有趋化T淋巴细胞定向移动的生理功能，在抗肿瘤免疫中有重要作用。
（一）、反转录酶的选择：
1．Money 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H 活性相对较弱；2．禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性；3．Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2+存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构；4．MMLV反转录酶的RNase H-突变体：商品名为Superscript 和SuperScriptⅡ。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。
（二）、合成cDNA引物的选择：
1．随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物
在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA；
2．Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A+)尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。由于Poly(A+)RNA仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物得到的cDNA 在数量和复杂性方面均要小；
3．特异性引物：最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA 3’端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR 扩增。
RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。起始RNA模板质量、纯度对本实验至关重要，必须完整，且不被基因组DNA污染。
三、实验材料、试剂与器材
1．第一链cDNA合成试剂盒（Takara公司）
2、模板RNA(上次实验提得)
3．包含Taq DNA聚合酶、dNTPmix及