文档介绍：实时荧光定量PCR技术原理、常见问题及解决方案
(Real time Quantitative PCR)
复旦大学基础医学院生理与病理生理学系
孟丹
主要内容
Real-time qPCR所有双链DNA分子成正比。
5’
3’
5’
3’
SG
SG
SG
SG
5’
3’
5’
3’
SG
SG
SG
SG
Emission
Excitation
-- 变性时，DNA双链分开，无荧光信号。
-- 延伸结束时，采集荧光信号。
SYBR Green I 工作原理
优点：
使用方便，成本低
-- 仅需设计两个引物
通用性好
-- 对DNA模板没有选择性
需要在反应结束时，对产物做融解曲线分析。
缺点：
SYBR Green与所有双链DNA结合
-- 引物二聚体或错误扩增产物造成假阳性
-- 只能检测单一模板，无法进行多重检测
SYBR Green I 工作原理
将温度对荧光强度的变化求导。(-dI/dT)
融解曲线 (dissociation curve)
确认PCR反应产物的特异性
对数图谱
原始图谱
融解曲线分析
-- 非特异性产物
-- 引物二聚体
Taqman 工作原理
探针与靶序列配对
（一段序列，两个基团，5’ 报告基团、3’淬灭基团）
完整的探针，报告基团R发射的荧光被淬灭基团Q淬灭，没有荧光产生。
聚合酶的5’外切酶活性
报告基团R与淬灭基团Q分离，发射荧光。
R
Q
Reporter
Quencher
R
Q
荧光信号强度与结合探针的DNA分子成正比。
在退火过程中，探针与靶序列结合
探针被Taq酶的5’- 3’ 外切酶活性剪切成片断
游离报告基团发出荧光
在延伸过程中，探针部分与靶序列分离
Taqman 工作原理
F
Q
Primer
F
Q
Primer
Degradation of TaqMan probe by DNA polymerase
F
Q
Reporter
Quencher
Suppression of fluorescence
Taqman 工作原理
SYBR Green I与Taqman 对比
Taqman
特异性高
-- 与特异靶序列结合
对模板有选择性
-- 可进行多重PCR反应
SYBR Green I
使用方便，成本低
-- 仅需设计两个引物
通用性好
--对DNA模板没有选择性
荧光定量PCR解析方法
绝对定量
样本中核酸的量（拷贝数、微克）
-- 检测某给定血液样本中的病毒颗粒数，有6000个拷贝
相对定量
不同样本中目的基因表达量的差异
-- 肿瘤组织和正常组织相比
某个基因的表达量mRNA改变了多少倍，改变了60倍
绝对定量
Sample
-- 样本起始浓度与Ct呈线性关系，根据已知拷贝的标准品作出标准曲线。
--根据未知样品的Ct值，推算出未知样本量。
以标准品为标杆
绝对定量的步骤
拷贝数计算
对标准品进行梯度浓度稀释
荧光定量PCR反应
建立标准品
未知样品Ct代入标准曲线
确定拷贝数
质粒提取
OD值测定
计算样本浓度
/样本分子量
/样本拷贝数
标准品进行5-6个
梯度稀释
标准品稀释倍数为10
Rn vs. Cycle number-- 扩增曲线
LogDNA vs. Ct -- 标准曲线
.
未知
104
103
106
105
102
10
标准曲线 (standard c