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质粒DNAde提取、定量、酶切与PCR鉴定
1. 一、实验目de学/A230de比值可以反响DNAde纯度；A260/A280=<〔芳香族〕或酚类物质A260/A280>,用RNA酶去除.
2. 质粒DNAde酶切鉴定：
3. ,或是与其附近de特异位点结合,并在结合位点切割双链DNA琼脂糖凝胶电泳：
琼脂糖是一种天然聚合长链状分子,可以形成具有刚性de滤孔,凝胶孔径de大小决定丁琼脂糖de浓度.
DNAb子在碱性环境中带负电荷,在外加电场作用下向正极泳动.
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时,有电荷效应与分子筛效应：不同deDNA分子量大小与构型不同,电泳时de泳动率就不同,从而分出不同de区带〔迁移速度与分子量de对数值成反比关系〕.
三、材料与方法：
〔一〕实验材料：
PCR仪器：PCR仪、台式离心机、微量加样枪、灭菌de薄壁离心管材料：菌液【大肠杆菌DH5a菌株〔pMD19-T质粒,含目de片段-绿色荧光蛋白GFP〕】、无菌去离子水、2XPremixTaq、引物质粒DNAde提取与制备仪器：包温培养箱、台式离心机、离心层析柱、Eppendorf管、微量加样枪、离心管材料：溶液P1〔S1〕、溶液P2〔S2〕、溶液P3〔S3〕、去蛋白液PE〔W1〕漂洗液WB〔W2〕、洗脱液EB〔Eluent〕、含pMD19-T质粒de大肠杆菌DH5a质粒DNAde定量〔紫外分光光度法〕仪器：比色杯、紫外分光光度计、微量加样枪材料：蒸僻水、质粒DNA质粒DNAde酶切鉴定仪器：、微量加样枪材料：无菌水、10州I酶切缓冲液BufR、质粒DNA、HindIII〔15U/ul〕、EcoRI〔12U/ul〕琼脂糖凝胶电泳仪器：凝胶电泳系统、凝胶成像系统材料：电泳指示剂、Gelview、TBE、琼脂糖、DNAMarker5000、电泳缓冲液
〔二〕:菌液煮沸10min,冷冻,室温解冻后离心取上活液
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r、
,用微量加样枪按下述顺序分别参加：*、刷物1(10mol/L)1、由物2(10mol/L)1、菌液5^1将PCR反响管置台式离心机中瞬时离心
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将装有PCR反响体系dePCR反响管放入PCR仪上进展如下操作：
①94C预变性5分钟后开始以下循环②循环为94C——30秒,50C——30秒,、72C——③72C5分钟④4C保温/将扩增后de基因用微量加样枪加到电泳仪de凝胶孔中
一U13000rpmx1min,弃上活
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质粒DNAde定量〔紫外分光光度法〕活洗比色皿•：用微量加样枪向比色皿•参加适
「量de蒸僻水刷洗,2~