文档介绍：: .
微生物菌种保藏
任务保臧细菌、放线菌、酵母菌、霉菌菌种计划学时6
任务目标
知识目标：
1个月。
2. 穿刺保藏法
此法是斜面保藏的一种改进方法，常用于保藏各种需气性细菌。方法是将培养基制成软琼脂（琼脂含量为斜面的1/2,一般为1%），，高度为试管的1/3。121°C高压灭菌后不制成斜面，用针形接种针将菌种穿刺接入培养基的1/2处。培养后的微生物在穿刺处及琼脂表面均可生长。然后覆盖以2~3mm的无菌液体石蜡。液体石蜡必须高压灭菌2次。这样的小管可在冰箱中保存以减少微生物的代谢作用。因此保藏效果较斜面为好。
3. 液体石蜡保藏法
此法是在新鲜的斜面培养物上，覆盖一层已灭菌的液体石蜡，再置于4〜5C冰箱保存。液体石蜡主要起隔绝空气作用，使外界空气不与培养物直接接触，从而降低对微生物氧的供应量。培养物上面的液体石蜡层也能减少培养基水分的蒸发。故此法是利用缺氧及低温双重抑制微生物生长，从而延长保藏时间。亦称矿物油保藏法，此方法简便有效，保藏时间2〜10年。
4. 甘油管保藏法
在液体的新鲜培养物中加入15%已灭菌的甘油，然后再置于—20°C或—70C冰箱中保藏。此法是利用甘油作为保护剂，甘油透入细胞后，能强烈降低细胞的脱水作用，而且在-20C或-70C条件下，可大大降低细胞代谢水平，但却仍能维持生命活动状态，达到延长保藏时间的目的。此法可保藏1〜10年。
5. 沙土管保藏法
将待保藏菌种接种于适当的斜面培养基上，经培养后，制成抱子悬液，无菌操作将抱子悬液滴入已灭菌的沙土管中，抱子将吸附在沙子上，将沙土管置于真空干燥器中，通过抽真空达到吸干沙土管中水分，然后将干燥器置于4C冰箱中保存。此法利用干燥、缺氧、缺乏营养、低温等因素综合抑制微生物生长繁殖，从而延长保藏时间。本法方法简便，设备简单，适用于产抱子和有芽抱的菌种保藏，可保存两年。
6. 冷冻真空干燥保藏法
此法包括三个步骤：首先将待保藏菌种的细胞或抱子菌悬液悬浮于保护剂
（如脱脂牛奶）中，目的是减少因冷冻或水分不断升华对微生物所造成的损害；继而在低温下（-70C左右）使微生物细胞快速冷冻；然后在真空条件下使冰升华，以除去大部分水分。冷冻真空干燥保藏法是目前最有效的菌种保藏方法之一。它的优点是：适用范围广，保藏期长，存活率高。采用此法保藏的菌种其保藏期一般可长达数年至十几年，均能取得良好保藏效果。缺点是设备昂贵，操作复杂。
【技能实训】斜面传代保藏
【实训准备】
1. 困种：细困、酵母困、放线困和霉困斜面困种。
2. 培养基：牛肉膏蛋白胨培养基，麦芽汁培养基，高氏1号培养基，马铃薯蔗糖培养基。
3. 器材：无菌试管，无菌吸管，接种环，冰箱，超净工作台，恒温培养箱，高压蒸汽灭菌锅等。
【操作过程】
1•接种取各种无菌斜面试管数支，将注有菌株名称和接种日期的标签贴上，贴在试管斜面的正上方，距试管口2〜3cm处。将待保藏的菌种用接种环以无菌操作法移接至相应的试管斜面上，细菌和酵母菌宜采用对数生长期的细胞，而放线菌和丝状真菌宜采用成熟的抱子。
2培养细菌37C恒温培养18〜24h,酵母菌于28〜30C培养36〜60h，放线菌和丝状真菌置于28°C培养4〜7d。
3. 保藏斜面长好后，可直接放入4C冰箱保藏。为防止棉塞受潮长杂菌，管口棉花应用牛皮纸包扎，或换上无菌胶塞，亦可用熔化的固体石蜡熔封棉塞或胶塞。
保藏时间依微生物种类而不同，酵母菌、霉菌、放线菌及有芽抱的细菌可保存2〜6个月，移种一次，而不产芽抱的细菌最好每月移种一次。此法的缺点是容易变异，污染杂菌的机会较多。
穿刺保藏
【实训准备】
1. 菌种：细菌、酵母菌、放线菌和霉菌斜面菌种。
2. 培养基:牛肉膏蛋白胨培养基，麦芽汁培养基，高氏1号培养基,马铃薯蔗糖培养基。
3. 器材：无菌试管，无菌吸管，接种针，冰箱，超净工作台，恒温培养箱，高压蒸汽灭菌锅等。
【操作过程】
1•接种将半固体培养基注入到试管中，使培养基距离试管口约2〜3cm。然后用穿刺接种法将菌种接种至半固体深层培养基中央部分，通常穿刺到半固体培养基的1/3处，注意不要穿透底部。
2. 培养在适宜的温度下培养，使其充分生长。
3. 保藏将培养好的菌种试管塞上橡皮塞或熔封后，置于4C冰箱保藏。
这种保藏方法一般用于保藏兼性厌氧细菌或酵母菌，〜1年之间。
液体石蜡保藏
【实训准备】
1. 菌种：细菌、酵母菌、放线菌和霉菌斜面菌种。
2. 培养基：牛肉膏蛋白胨培养基，麦芽汁培养