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双荧光素酶报告实验
实验名称：双荧光素酶测报告基因表达的改变（以萤火虫荧光素酶为报告基因，以海肾荧光素酶为内参基因）可以定量反映miRNA对目的基因的抑制作用。结合定点突变等方法进一步确定miRNA与靶基因3’UTR的作用位点。
从这两个图谱中可以发现，ppGL3-Basic这个载体主要是用于评估miRNA与靶基因3’UTR的结合，靶基因的3’UTR放在荧光素酶的后面，这个荧光素酶是荧火虫荧光素酶，而pRL-TK这个载体则表达海肾荧光素酶，将这两个质粒共同转染进入293细胞中来检测荧光时，pRL-TK这个质粒起到一个内参的作用。
3、pmir-GLO将荧火虫荧光素酶与海肾荧光素酶构建到一个载体上，偏差更小且单质粒转染比双质粒共转染更简单。该质粒也是由promega公司开发的，图谱如下所示：萤光素酶是理想的报告基因，因为哺乳动物细胞中不含内源性萤光素酶，一旦转录完成立刻就生成功能性的萤光素酶，同时在所有的化学发光反应中，它的光产物具有
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最高的量子效率，检测灵敏度高。荧光素酶报告基因被广泛用于miRNA靶基因验证。
荧光素酶报告基因的原理在于miRNA主要通过作用于靶基因的3’UTR起作用，可以将目的基因3’UTR区域构建至pGL3-basic载体中报告基因Luciferase的后面，构建荧光素酶质粒。然后转染至细胞中，通过比较过表达或者干扰miRNA后，检测报告基因表达的改变（监测萤光素酶的活性变化）可以定量反映miRNA对目的基因的抑制作用。结合定点突变等方法进一步确定miRNA与靶基因3’UTR的作用位点。
同时，为了减少内在的变化因素，比如：培养细胞的数目、细胞转染和裂解的效率等对实验准确性的影响，将带有海肾荧光素酶基因（Rinilla luciferase）的质粒（phRL-TK）作为对照质粒与报告基因质粒共转染细胞，提供转录效率的内对照，使测试结果不受实验条件变化的干扰。在测量过程中，首先加入荧光素酶检测试剂Luciferase Assay Reagent II时产生萤火虫荧光信号，这样先测量萤火虫荧光素酶活性。定量萤火虫荧光强度之后，再在同一样品中加入Stop&Glo Reagent试剂，将上述反应淬灭，并同时启动海肾荧光素酶反应，进行第二次测量，称之为双荧光素酶报告基因实验。
实验检测步骤：
一、样品准备：
1质粒转染细胞
（1）细胞铺板：将细胞按50%的密度接种到细胞培养12孔板内。
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（2）转染：16h左右细胞约70%时转染萤光素酶报告基因质粒，每个样品设置3个复孔。首先设计四组：
1. 空白组（转染试剂+细胞）
2. 质粒