文档介绍：第十二章分子生物学研究方法
SNP概述
单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP):单个核苷酸的突变而引起的多态性。
单体型(Haplotype):染色体上某一区域的一组相关联的SNP等位位点被称作单体型。相邻SNPs的等位位点倾向于以一个整体信息传递给后代。
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SNP分类:
基因编码区SNP(cSNP):
同义cSNP:SNP导致的编码序列改变并不影响蛋白质的氨基酸序列,突变碱基和未突变碱基含义相同。
非同义cSNP:碱基改变使蛋白质序列发生变化,从而影响蛋白质的功能。常是生物性状发生改变的直接原因。
基因调控区SNP(pSNP):影响基因表达量的多少。
基因间随机非编码区(rSNP):
cSNP、pSNP在功能和疾病发生、发展方面具有更重要的意义。
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SNP检测技术
基因芯片、Taqman技术、分子信标、焦磷酸测序。
Taqman技术原理:
探针设计上,利用荧光共振能量转换(FRET)技术,探针5'和3'端分别用特殊的染料标记,称为供体-受体染料对或引爆-猝灭染料对。
正常情况下,由于探针5'端荧光基团和3'端猝灭基团紧邻在一起,供体所发荧光由于其光谱在空间上接近受体染料而被猝灭,只有当两者分离时才能检测到供体所发出的荧光。
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Taqman技术的基本原理是利用Taq酶的5'核酸外切酶活性,PCR反应中除了两个传统的PCR引物P1、P2外,还有第三个引物P3(等位特异性Taqman探针),含有待检测的SNP位点,特异结合在P1结合位点的下游。P3探针的5'端和3'端分别标有荧光基团和猝灭基团,因P3的3'端被猝灭基团封阻而不能以自身为引物进行扩增。
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PCR反应中,Taq酶以P1为引物合成新的DNA链,随着反应的进行,Taq酶接触到P3并激发其5→3外切酶活性,使P3从5端开始降解,最后DNA链得以延伸,而P3探针上的荧光基团和猝灭基团由于不再在一个分子上,荧光基团释放而发出荧光信号。
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焦磷酸测序法:
核心:由四种酶催化的同一反应体系中的酶级联反应。
四种酶:DNA聚合酶(DNA poly merase)、ATP硫酸化酶(ATP sulfurylase)、荧光素酶(luciferase)、双磷酸酶(apyrase)。
底物:5’-磷酰硫酸(adenosine 5’-phosphosulfate, APS)、荧光素(luciferin)。
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每轮测序反应中,只加入一种dNTP,如果该dNTP与模板配对,聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团(PPi),PPi可最终转化为可见光信号,并由PyrogramTM转化为一个峰值,每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比,然后加入下一种dNTP,继续DNA链的合成。
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第一步:1个特异性的测序引物和单链DNA模板结合,然后加入酶混合物(DNA Polymerase、ATP硫酸化酶、荧光素酶和双磷酸酶)和底物混合物(5’-磷酰硫酸APS和荧光素Luciferin)。
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