文档介绍：4光谱分析技术
光学导论
光谱分析≠光学分析！
光学分析 = 光谱分析 + 非光谱分析
非光谱分析：基于物质与辐射的相互作用，测量辐射的某些性质，如折射、散射、干涉、衍射和偏振等变化的分析方法
光学导论
光谱分析 C-C，C-H ）
能量很高，λ<150 nm
2. n→σ* 跃迁：
含杂原子饱和基团（-OH，-NH2）
能量较大，λ150~250 nm
3. π→π*跃迁：
不饱和基团（C=C，C ≡ C ）
能量较小，λ~ 200nm
共轭体系，E更小，λ> 200nm
4. n→π*跃迁：
含杂原子不饱和基团（C ≡N ，C=O ）
能量最小，λ 200~400nm
基本原理
影响紫外-可见吸收光谱的因素
1 共轭效应
共轭体系越长， π与π*的能量差越小，红移效应和增色效应越明显。
2 立体化学效应
空间位阻、跨环效应
3 溶剂的影响
溶剂效应
4 体系pH的影响
Tips：
由于溶剂对电子光谱图影响很大，因此，在吸收光谱图上或数据表中必须注明所用的溶剂。与已知化合物紫外光谱作对照时也应注明所用的溶剂是否相同。在进行紫外光谱法分析时，必须正确选择溶剂。
朗伯-比尔定律——定量分析的基础
当强度为I0的一定波长的单色入射光束通过装有均匀待测物的溶液介质时，该光束将被部分吸收Ia，部分反射Ir ，余下的则通过待测物的溶液It ，即有：
I0=Ia + It + Ir
朗伯-比尔定律
如果吸收介质是溶液（测定中一般是溶液），式中反射光强度主要与器皿的性质及溶液的性质有关，在相同的测定条件下，这些因素是固定不变的，并且反射光强度一般很小。所以可忽略不记，这样：
I0=Ia+ It
朗伯-比尔定律
透光率——透光率表示透过光强度与入射光强度的比值，用T来表示，计算式为：T = It/I0
T常用百分比（%）表示。
吸光度——透光率的倒数的对数叫吸光度。用A表示：
A = -lgT = lg(I0/It)
朗伯-比尔定律
当用一束强度为I0的单色光垂直通过厚度为b、吸光物质浓度为c的溶液时，溶液的吸光度正比于溶液的厚度b和溶液中吸光物质的浓度c的乘积。
朗伯-比尔定律
Io
It
b
a
A = lg(I0/It) = Kbc
朗伯-比尔定律
吸光系数：
当溶液浓度c的单位为g/L,溶液液层厚度b的单位为cm时，K叫“吸光系数”，用a表示，其单位为L·g-1·cm-1
摩尔吸光系数：
当溶液浓度c的单位为mol/L，液层厚度b的单位为cm时，K叫“摩尔吸光系数”，用ε表示，其单位为L·mol-1·cm-1
ε= aM (M为吸光物质的分子量)
紫外-可见分光光度计
岛津 UV-2450
工作原理基仪器结构框图
光源
碘钨灯
氘灯
单色器
测量池
参比池
样品池
光电倍增管
数据处理和仪器控制
光源
样品池
单色器
检测器
数据处理
仪器控制
紫外-可见分光光度计
紫外-可见分光光度计
单光束分光光度计
双光束分光光度计
紫外-可见分光光度计
吸收池的材料
玻璃
360 nm
mm
紫外-可见分光光度计
石英
200 nm
mm
紫外-可见分光光度计
吸收池的形状
可拆卸圆形测量池
两面透光
圆形测量池
两面透光
1cm 长方形测量池
两面透光
气体测量池
两面透光
微量测量池
两面透光
流动测量池
两面透光
紫外-可见分光光度计
思考题
为什么紫外可见分光光度计的最大吸收值只能到3或者5，超过该值便会造成数据溢出？
生物分子的紫外-可见吸收光谱
糖
紫外可见光谱在糖的分析中, 主要作定量检测。最大吸收波长为218 nm, 多糖最大吸收波长为206 nm。
○
生物分子的紫外-可见吸收光谱
脂
脂
肪
○
○
230~240 nm, 于有机溶剂中（如乙醇、正己烷等）
类
脂
维生素A
326 nm于乙醇
番茄红素
番茄红素在溶剂正己烷中的谱图
番茄红素在溶剂石油醚中的谱图
生物分子的紫外-可见吸收光谱
生物分子的紫外-可见吸收光谱
蛋白质
Proteins in solution absorb ultraviolet light with absorbance maxima at 280