文档介绍：实 验 六
重组克隆子的鉴定 （菌落PCR技术）
从本节课起，开始考察同学们的实验操作
1. 无菌操作：酒精灯的合理使用，保持枪头盒，EP管盒的无菌，各种溶液不被污染。
2. 独立完成实验：不要随意走动串门，不要相互加各
基础研究
遗传病家系分析
传染病诊断
古生物及进化分析
法医鉴定和考古学研究
PCR方法应用
成功PCR的特点
特异性：高度特异地产生一个扩增带
有效性：高效率，较少的循环获得较多的 扩增产物
忠实性：体现在由DNA聚合酶诱导的错配率非常低
两个关键
一、正确的引物设计
引物长度和GC%含量 15-60 bp，40%-60%
Tm值： Tm=4℃(G+C)+2℃(A+T )
Ta=Tm - 5℃
引物的端部 3’端起始碱基决定特异性，错配延伸效率 T>G=C>A
5’端碱基可呈游离状态，可被修饰（如加酶切位点，引入突变位点，插入启动子序列等）
4. 引物无回文对称结构（发夹结构）
5. 引物自身不能配对
5’----AGCT3’
3’TCGA----5’
引物二聚体（反应底物，与靶序列竞争酶和dNTP）
6. 二引物间不能配对
7. 二引物的Tm值相近
二、PCR反应条件
模板：
质粒DNA，扩增后的DNA，cDNA ，基因组DNA（机械剪切或稀有限制酶酶切），单链和双链， 拷贝数102-105
引物：
-, 分装小管保存
dNTP
20-200uM，4种dNTP终浓度相等
Mg2+浓度
-
pH
半衰期 ℃ >2h
95℃ 40min
℃ 5-6min
错误参入率: 每2x104核苷酸中有一个
无3’-5’外切酶活性,无校对活性
3’端加poly(dA),非模板依赖碱基,T载体
100µ-5U
最适反应温度: 72℃
Taq酶(DNA聚合酶)
PCR反应的忠实性
Taq酶没有3’-5’的外切活性而不能自行校正，从而导致错掺
测序、定点诱变和克隆
减少错掺的对策：
加入Taq酶后迅速反应，避免低温下进行的链延伸；酶浓度不可过大；dNTP 不可过浓；Mg2+浓度适中
PCR平台效应
定义：PCR进行到一定次数后产物的积累由指数方式 向线性方式变化或反应根本停止。
原因：
酶的热失活
抑制酶活的物质
dNTP的稳定性
非特异性片段的竞争
模板的自身退火
酶与dNTP的相对减少
容易污染
PCR反应的灵敏度高,极易产生假阳性结果(一定要做阴性对照)
污染来源：
样品污染即样品间的交叉污染
产物污染
其它污染：环境污染和实验使用的器材试剂
防治方法：
短波紫外线照射30分钟；
器皿类可用稀酸碱泡，使碱基脱嘌呤；PCR管、枪头等一次性使用；
试剂湿热灭菌后小管分装；
加模板DNA后盖紧盖子，打开盖子前离心甩下小液滴，再慢慢打开，防止开盖过快，形成气溶胶。
每次反应都应设立阳性，阴性对照。
实验操作
Section 2
实验材料
仪器：PCR扩增仪
琼脂糖凝胶电泳系统
材料：
DNA模板
4种dNTP
引物1，2
Taq酶
1、DNA模板的制备(挑取细菌沉淀)
2、引物设计与合成(教师已做)
3、PCR扩增GFP基因
4、琼脂糖电泳检测
【实验步骤】
1、DNA模板的制备
质粒DNA
扩增后的DNA
cDNA
基因组DNA(机械剪切或稀有限制酶酶切)
重组细菌(本次试验DH5a/pET28a-EGFP)
单链和双链,拷贝数102-105
2、本次实验引物的设计与合成
P1 XhoI
5’GC CTC GAG CTT GTA CAG CTC GTC CAT G3’
P2 EcoRI
5’GC GAA TTC GTG AGC AAG