文档介绍：2008-11-27 1 ? PCR (P olymerase C hain R eaction ,聚合酶链反应)是一种选择性体外扩增 DNA 或 cDNA 的技术。?特点:它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点。?分类:最常用的 FQ-PCR 与 RT-PCR 。返回 2008-11-27 2 ? RT-PCR :逆转录 PCR ,将 mRNA 逆转录后再进行 PCR 扩增,产物通过电泳检测基因的表达情况, 又称半定量 PCR 。? FQ-PCR :实时荧光定量 PCR ,在 RT- PCR 反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个 PCR 进程,最后通过曲线对未知模板定量的方法。?联系及区别: RT-PCR 只能进行定性; FQ-PCR 才能做到定量。返回 2008-11-27 3 ?以 FQ-PCR 为例,体系中的组分如下 10 × buffer(Mg 2+ free) MgCl 2( 25mM ) dNTP ( 25mM ) 上游引物( 10 μM) 下游引物( 10 μM) 探针或染料( 10 μM) Taq 酶( 5u/ μl) ddH 2O cDNA 模板返回 2008-11-27 4 ? stage1 94 ℃ 2min ? Stage2 探针: 94 ℃ 20sec , 55 ℃(基因的复性温度) 20sec , 60 ℃ 30sec , 45 cycles 染料: 94 ℃ 20sec , 55 ℃(基因的复性温度) 20sec , 72 ℃ 30sec , 80 ℃ 20sec , 45 cycles 返回 2008-11-27 5 go 2008-11-27 6返回 2008-11-27 7 ?用样本的基因的 Ct值减去对应的内参的 Ct值,得到△ Ct 值例子:假设 1号样本的基因的 Ct值为 23 ,1号样本的内参的 Ct值为 19 ,则 1号样本的△ Ct值=23-19=4 。根据△ Ct值就可以分析我们的基因的表达情况了, △ Ct 值越大,则样本的基因的表达越低。?取一个参照组的△ Ct值的平均值作为对照基准,用每个标本的△ Ct值减去参照组的△ Ct值,得到△△ Ct值。参照组是指你所要比较的对象,比如空白对照组等。?计算出 2 - △△ Ct值,就可以进行统计分析了。 2 - △△ Ct值的意义:每个样本的基因的表达是参照组的基因表达平均值的多少倍?也就是我们说的相对定量。返回 2008-11-27 8 ? Rest 软件?分析后处理分析完结果后,请根据需要给出拷图要求通过书面或者邮件的形式给出下列要求拷图主要是为了说明各组的表达的差异,也就是选取每个组选出有代表性的标本组成一张图。返回 2008-11-27 9 ?标准曲线有什么用? ?解答:标准曲线可以指示基因的扩增效率,并且在有已知拷贝数的标准品的情况下可以算出标本的起始拷贝数。但是我们做的大部分都是相对定量,就是看标本间的表达的关系,并没有用已知拷贝数的标准品做绝对定量的标准曲线,并且也没有必要做出他们的起始拷贝数。我们只需要做出他们之间关系就可以了。因此我们做的标准曲线就是指示基因的扩增效率,而没有做出样本的起始表达量,我们也可以在图上看出他们的关系,就是相对的倍数关系。扩增效率就是 10 - 1/k,其中 k就是标准曲线的斜率。我们算出的效率基本一致就可以了,那样我们的相对定量才成立,并且在统计时,不一定要用算出的扩增效率,用 2也是可以的。返回 2008-11-27 10