文档介绍：超氧化物歧化酶SOD的生产---林志豪
粗酶液在搅拌下缓慢加入固体硫酸铵至饱和浓
度60%，持续搅拌15min，6000r/min离心
15min，得到超氧化物歧化酶SOD的生产---林志豪
粗酶液在搅拌下缓慢加入固体硫酸铵至饱和浓
度60%，持续搅拌15min，6000r/min离心
15min，得到SOD酶沉淀
4.
，
5mL中，然后6000r/min离心15min，放弃沉
淀，取上清液，用凝胶sephacylS-200进行纯
化，然后超滤浓缩。
5.
用紫外分光光度计测定浓液的蛋白含量
6.
将浓缩冷冻干燥后即得成品。
四、超氧化物歧化酶（SOD）的测定
原理
连苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，释放
出O2-,生成带色的中间产物。在自氧化过程的初
始阶段，黄色中间产物的积累在滞后30-45s后
就与时间呈现性关系。中间产物在325nm处有
强烈的光吸收，在有SOD存在时能催化生成O2
和H2O2，从而阻止了中间产物的积累，通过计
算就可以求出SOD的活力。
仪器
紫外分光光度计、pH计,离心机
试剂
⑴：
⑵pH= Tris-HCl缓冲溶液
①（Tris）溶液:
NH2C(CH2OH)3
,溶解，定容至100ml
②: (9)ml浓盐酸，稀释至
1000ml
③5 （Tris）溶
液
毫升。
(保存温度: 常温密封避光保存)
测定步骤
1、 称取6g样品，加于现在冰箱中放置的缓冲液60ml(样品的10倍，视情况定)，在冰浴中研磨成匀浆，四层纱布过滤，滤液经4000r/min 离心20min,取上清液用于酶活测定。
2、连苯三酚自氧化速率的测定
，在25℃水浴中保温15min,加入10 连苯三酚液，迅速摇匀
空白：，在25℃水浴中保温15min, 加入10 缓
冲液，迅速摇匀
倒入光径1cm的比色杯中，在325nm波长下于恒温池中每隔30s测A值一次
计算线形范围内，每1minA的增值，此即连苯三酚的自氧化速率，
测定方法与测连苯三酚自氧化速率相同，
，在25℃水浴中保温15min,加入3ml酶液，加入10 连苯三酚液，迅速摇匀
空白：，在25℃水浴中保温15min, 加入3ml酶液，加入10 缓冲液，迅速摇匀
计算加酶后连苯三酚自氧化速率
样品酶活单位表示，SOD酶活单位（U）/g鲜重
样品酶活单位=
式中——酶样品在325nm处每分钟光密度变化值
V——反应液体积
n——酶液稀释倍数（若酶液足够多，可不稀释即n为1）
大量试验和临床应用表明， 无论何种给药方式，除罕见的超敏反应外，SOD对人体无毒性。虽然SOD是Mr在30 000以上的蛋白质， 但却未发现具有抗原性， 其原因也正在进一步研究中。
在破碎细胞时要注意安全，一定要破碎的彻底
PH的控制力度很重要，以及在实验中的温度等
要学会正确使用分光光度计
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