文档介绍：安捷伦HPLC色谱柱选择
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分离模式的选择
样品
溶于有机溶剂
溶于水
溶于四氢呋喃
非离子化
离子化
溶于有机溶剂
溶于水
溶于正己烷
溶于甲醇或甲醇/水
或乙***或乙***/水
用硅胶nd
Eclipse XDB
Bonus-RP
Extend
ZORBAX Rx
多孔硅胶微球
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色谱柱尺寸 --- 对色谱分离的影响
• 短柱 (15-100mm) - 运行时间短, 柱压低
• 长柱 (150-250mm) - 分辨率高, 运行时间长
• 窄径柱 ( ) - 检测器灵敏度高
• 宽径柱 (3-) - 载样量高
C-18柱---性能影响因素
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颗粒形状 --- 对色谱分离的影响
当使用黏度较大的流动相50:50=MeOH:H2O时, 球型颗粒可以降低柱压, 延长色谱柱寿命
C-18柱---性能影响因素
球形
不规则形
粒径 --- 对色谱分离的影响
较小的颗粒柱效较高, 但会引起柱压过高. µm粒径的常用于分离复杂的多组份样品, 而组份单一的样品多采用5µm的粒径
µm µm 5µm 7µm 10µm
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表面积 --- 对色谱分离的影响
高表面积对于多组份样品的分离具有较强的保留能力, 柱容量和分离度. 表面积低的填料通常能迅速达到平衡状态, 对于梯度淋洗尤为重要
C-18柱---性能影响因素
孔径 --- 对色谱分离的影响
大孔的填料颗粒可以延长溶质大分子在填料表面滞留的时间, 达到充分分离, 改善峰形
样品 MW 4, 000, 选择 80Å 的孔径
样品 MW > 4, 000, 选择 300Å 的孔径
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大孔径填料适用于大分子分析
大孔径300Å 全多孔色谱柱
可用于分离蛋白质和多肽
分子量虽小但hydrodynamic volume(水动力学体积)较大的分子
Poroshell 色谱柱
高流速下, 高柱效分析大分子的蛋白质和多肽
色谱柱填料孔径必须适合待测物分子自由进出填料孔, 与孔内表面的键合相进行分离分配
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300Å 孔径可改善蛋白质和多肽峰形
0
300SB-C18 (300Å)
SB-C18 (80Å)
PW 1/2
Leu Enkephalin
. = 556
Angiotensin II(血管紧张素 II)
. = 1046
Insulin B
. = 3, 496
Cyt C
. = 12, 327
Rnase(核糖核酸酶)
. = 13, 684
Lysozyme(溶菌酶)
. = 13, 900
孔径, 分子量对峰宽的影响(梯度分离)
选择合适的
填料孔径分析
大分子可获得
最佳峰形
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300Å 孔径可改善大分子的峰形 1 Å=1*10-10m
色谱柱: x 150 mm, 5 mm
流动相: 60% MeOH: 40% % 三***乙酸
流速: mL/min
温度: RT
检测器: UV 282 nm
溶液中的分子尺寸决定适宜的色谱柱孔径
窄的峰宽表明待测分子进入填料孔没有受到阻碍
SB-C3 (80Å)
300SB-C3
(300Å)
Pw 1/2 =
Pw 1/2 =
O
O
N
HO
HO
CHO
HO
O
H
O
H
O
O
O
O
O
O
O
CH
3
CH
3
OCH
3
OCH
3
CH
3
CH
2
CH
2
CH
2
CH
3
CH
3
CH
3
H
3
C
H
3
C
H
3
C
0