文档介绍：第六章真核基因在大肠杆菌中的表达
真核基因的大肠杆菌表达体系
大肠杆菌的表达载体
克隆的真核基因在大肠杆菌细胞中的表达
影响克隆基因在大肠杆菌中表达效率的因素
大肠杆菌表达体系
克隆基因正确表达的基本条件
克隆基因表达活不一的mRNA混合物
过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达，其原因如下：
转录产物越长，RNA聚合酶转录一分子mRNA所需的时间就相应增加，外源基因本身的转录效率下降；
如果外源基因下游紧接有载体上的其它重要基因或DNA功能区域，如选择性标记基因和复制子结构等，则RNA聚合酶在此处的转录可能干扰质粒的复制及其它生物功能，甚至导致重组质粒的不稳定性；
过长的mRNA往往会产生大量无用的蛋白质，增加工程菌无谓的能量消耗；
更为严重的是，过长的转录物往往不能形成理想的二级结构，从而大大降低外源基因编码产物的翻译效率。
目前外源基因表达质粒中常用的终止子是来自大肠杆菌rRNA操纵子上的rnT1T2以及T7噬菌体DNA上的Tφ。对于一些终止作用较弱的终止子，通常可以采用二聚体终止子串联的特殊结构，以增强其转录终止作用。
终止子也可以通过特殊的探针质粒从细菌或噬菌体基因组DNA中克隆筛选
强终止子的选择与使用
pCP1
Apr
ori
Tcr
筛选Apr、Tcs的转化子

外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的频率，而且在很大程度上还与mRNA的翻译起始效率密切相关。大肠杆菌细胞中结构不同的mRNA分子具有不同的翻译效率，它们之间的差别有时可高达数百倍。mRNA翻译的起始效率主要由其5‘ 端的结构序列所决定，称为核糖体结合位点（RBS）
大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个特征结构要素：
位于翻译起始密码子上游的6-8个核苷酸序列5’ UAAGGAGG 3’，即Shine-Dalgarno（SD）序列，它通过识别大肠杆菌核糖体小亚基中的16S rRNA 3’端区域3’ AUUCCUCC 5’并与之专一性结合，将mRNA定位于核糖体上，从而启动翻译；
翻译起始密码子，大肠杆菌绝大部分基因以AUG作为阅读框架的起始位点，但有些基因也使用GUG或UUG作为翻译起始密码子；
SD序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成；
基因编码区5’ 端若干密码子的碱基序列
核糖体结合位点的结构

显著的增加异源基因在大肠杆菌中的表达效率。
5. 转译终止子
mRNA转译终止必须存在终止密码子。
大肠杆菌格外偏爱使用终止子UAA，尤其是在其后加上U形成UAAU四联核苷酸的情况下，转译终止的效率便会得到进一步的增强。
T7噬菌体基因10 前导序列（简称g10-L序列）;
大肠杆菌atpE基因mRNA5’-UTR中富含U的区段。
1、选用一种适当的核酸内切酶，消化切割大肠杆菌的染色体DNA，
2、接着将切割产生的DNA限制片断群体，同一种无启动子的质粒载体重组，按实验设计要求使克隆的片断恰好插入在紧邻报告基因的上游位置
3、随后把此重组混合物转化给大肠杆菌寄主细胞，构成质粒载体基因文库，并检测报告基因的表达活性。
二、功能启动子的分离
一般程序：
报告基因（reporter gene）：
特指那些编码产物可以被快速测定的功能核苷酸编码单元（半乳糖苷酶基因、碱性磷酸酶基因、萤光素酶基因、半乳糖激酶基因以及***霉素乙酰转移酶基因、GFP等）。
追踪某种特定的DNA结构（重组质粒）是否已经导入寄主细胞、抑或是器官和组织；也可用来同任何一种目的启动子连接，因此其表达活性可作为检测启动子功能的依据。
利用CAT基因
进行功能启动子
的分离和活性测定
无启动子的CAT质粒载体
Ecoli DNA
构建Ecoli基因文库
细胞裂解物、
14C标记得***霉素
乙酰辅酶A
薄层层析
放射自显影
CAT活性的检测：
***霉素乙酰转移酶
可以催化***霉素（2-或3-）
发生乙酰化作用。
首先在大肠杆菌质粒pBR316（含有一个tet基因、HindⅢ 位点）上的tet的启动子序列中插入一个EcoR1的酶切位点（ pBRH3B, pBRH1 ），使之失活。
将纯化的细菌染色体DN***断，克隆在pBRH3B或 pBRH1 的EcoR1限制性位点上；转化给对tet敏感的大肠杆菌寄主细胞。
使用tetr作报告基因分离功能启动子
能够检测启动子活性强弱的新型质粒载体系统。
来源于pBR322
用galK（半乳糖激酶基因）作报告基因分离功能启动子
转译终止密码子
无启动子的gal