文档介绍：原代细胞的培育
细胞试验设计
陈加祥，
第一节、原代细胞培育
基本概念：
来源于胚胎、组织器官及外周血，经特殊分别方法制备而来的原初培育的细胞称之为原代细胞。
初代培育物起先第一次传代培育后的细胞，即称之为细胞系（Cell
（5）漂洗：将含有血清、钙、镁的培育基沿瓶壁缓缓加入，中止消化反应，漂洗2-3次后，加入完全培育基。
（6）机械分散：接受吸管吹打或振荡法，使细胞充分散开后用纱网过滤后分瓶培育。
留意事项
（1）组织块必需漂洗2-3次以除去组织中的钙、镁离子和血清对胰蛋白酶和EDTA的抑制作用。
（2）胰酶浓度不宜过高，作用时间不能太长，以免过量损伤细胞。
（3）消化后组织不仅要尽量弃去消化液，而且动作要温顺。
三、原代细胞的培育方法
悬浮细胞培育法: 如淋巴细胞
组织块培育法：如血管平滑肌细胞
消化培育法：如血管内皮细胞
1. 淋巴细胞分别原理（密度梯度离心）
淋巴细胞分别液：由60%的聚蔗糖Ficoll 2份和34%的泛影葡胺1份混合制成。
特性：分子量大、无化学活性、
血液中各种细胞的比重不同：
淋巴细胞与单核细胞：
粒细胞和红细胞：
将血液加至分别液上，通过离心，可使确定比重的细胞按相应密度梯度进行分布。
2. 淋巴细胞分别步骤：
1. 抽取静脉血2ml，注含有肝素的无菌试管中摇匀，加入2ml Hanks溶液稀释。
2. 吸管吸取稀释血液沿试管壁缓缓加到含有2ml淋巴细胞分别液的试管中（血液:Hanks液:淋巴细胞分别液的比例为1:1:1）。
3. 水平式离心2000r/min×20min
4. 用平口吸管当心吸取中层呈白色雾状的细胞层，用Hanks溶液洗涤两次，每次离心1500 r/min×10 min。
5. 弃上清，加RPMI-1640培育液1 ml混匀，取少许进行细胞计数及活力测定。
6. 贴壁法区分单核细胞（易贴壁）和淋巴细胞
留意事项
1. 抽血后在2小时内运用。
2. 留意将稀释后的血轻轻地沿管壁铺在聚蔗糖液面上，避开破坏其界面。
3. 在收集单核细胞和淋巴细胞时，将吸管轻轻插入该层后，沿管壁轻轻旋转吸取细胞。
2、组织块培育法（组织培育）
举例：贴块法培育血管平滑肌细胞
步骤：
铺瓶：大鼠经颈动脉放血后，无菌操作取一段胸主动脉，置于含Hank‘s液的平皿中漂洗3次，将血凝块洗干净后剥除外膜的纤维脂肪层，纵行剪开血管，刮血管内膜2~3遍，将中膜剪成约1 mm2大小碎片，匀整铺在瓶底，25 mL培育瓶可接种20~30小块。
轻轻翻转培育瓶，使瓶底朝上，然后于瓶内加入适量培育基盖好瓶塞，将瓶倾斜放置在37℃温箱内。
翻瓶：待其稍干燥后，将培育瓶缓慢翻转平放，静置培育。
培育24小时后再补液，培育初期移动和视察时要轻拿轻放，起先几天尽量不去搬动，以利贴壁和生长，培育3~5天时可换液。
7-9天起先有细胞从组织块四周爬出
14天左右细胞融合成大片
3. 消化法原代培育HUVEC
（1）无菌条件下取正常分娩胎儿的簇新脐带(20 cm)，用PBS冲洗脐带至无血色液体流出。
（2）%的Ⅱ型胶原酶溶液，夹闭脐带两端，置于37℃培育箱消化。15 min后，收集消化液，并加入含20％胎牛血清的M199培基10 ml终止消化，注入M199培基反复灌洗脐带，收集冲洗液，与消化液一起于1000 rpm离心5 min。
（3）弃上清液，加入全M199培育液（含20%胎牛血清、100 ng/ml VEGF）4 ml，吹打使细胞重新悬浮，移入培育瓶中，静置培育。
（4）24 h后换液，以后每隔3天换液一次，约7天左右细胞长满汇合，可以传代。
（5）运用前运用标记因子CD31或VIII因子对内皮细胞进行鉴定。
四、培育细胞的纯化
1、自然纯化
2、人工纯化
（1）酶消化法
（2）机械划除法
（3）反复贴壁法
（4）克隆法
（5）培育及限定方法
（6）流式分选
1、自然纯化
即利用某一种类细胞的增殖优势，而排挤其他细胞生长，靠自然的增殖潜力最终留下生长优势细胞，去除其他细胞。
无法人为选择细胞，时间长
有些恶性肿瘤细胞可以通过此方法，自然纯化建立细胞系。
2、人工纯化
（1）酶消化法
如上皮细胞和成纤维细胞对胰酶的耐受性不同：消化细胞时，常是成纤维细胞先脱壁，而上皮细胞要消化相当长的时间才脱壁，特殊是在原代培育和培育早期这种差别尤为明显，因而接受多次差别消化法将上皮细胞和成纤维细胞分开。
（2）机械划除法
上皮细胞和成纤维细胞同时出现，混杂生长。每种细胞都以小片或区