文档介绍：专业
【双荧光素酶报告实验】
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实验原理
实验步骤
参考案例
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mic和阴性对照质粒分别共转染至肝癌细胞Huh7中，转染24 h后裂解细胞，12000 rpm离心1 min，收集上清。使用双荧光素酶报告基因检测系统 (Dual-Luciferase® Reporter Assay System，E1910，Promega) 检测荧光素酶活性。每个细胞样品中加入100 μL萤火虫荧光素酶工作液检测萤火虫荧光素酶 (Firely lueiferase)，加入100 μL海肾荧光素酶工作液检测海肾荧光素酶 (Renilla lueiferase)，以萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶作为相对荧光素酶活性。实验重复3次。
03 参考案例
案例一
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分别构建靶基因CADM1双荧光素酶报告基因载体以及与miR-XX结合位点突变的突变体：PGLO-CADM1 WT和PGLO-CADM1 MUT。将两种报告质粒与过表达质粒miR-XX mimic和阴性对照质粒分别共转染至肝癌细胞Huh7中，转染24 h后裂解细胞，12000 rpm离心1 min，收集上清。使用双荧光素酶报告基因检测系统 (Dual-Luciferase® Reporter Assay System，E1910，Promega) 检测荧光素酶活性。每个细胞样品中加入100 μL萤火虫荧光素酶工作液检测萤火虫荧光素酶 (Firely lueiferase)，加入100 μL海肾荧光素酶工作液检测海肾荧光素酶 (Renilla lueiferase)，以萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶作为相对荧光素酶活性。实验重复3次。
Step1：构建载体
03 参考案例
案例一
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分别构建靶基因CADM1双荧光素酶报告基因载体以及与miR-XX结合位点突变的突变体：PGLO-CADM1 WT和PGLO-CADM1 MUT。将两种报告质粒与过表达质粒miR-XX mimic和阴性对照质粒分别共转染至肝癌细胞Huh7中，转染24 h后裂解细胞，12000 rpm离心1 min，收集上清。使用双荧光素酶报告基因检测系统 (Dual-Luciferase® Reporter Assay System，E1910，Promega) 检测荧光素酶活性。每个细胞样品中加入100 μL萤火虫荧光素酶工作液检测萤火虫荧光素酶 (Firely lueiferase)，加入100 μL海肾荧光素酶工作液检测海肾荧光素酶 (Renilla lueiferase)，以萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶作为相对荧光素酶活性。实验重复3次。
Step2：共转染
Tip：此处使用的是实验中相应的肿瘤细胞
03 参考案例
案例一
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分别构建靶基因CADM1双荧光素酶报告基因载体以及与miR-XX结合位点突变的突变体：PGLO-CADM1 WT和PGLO-CADM1 MUT。将两种报告质粒与过表达质粒miR-XX和阴性对照质粒分别共转染至肝癌细胞Huh7中，转染24 h后裂解细胞，12000 rpm离心1 min，收集上清。使用双荧光素酶报告基因检测系统 (Dual-Luciferase® Reporter Assay System，E1910，Promega) 检测荧光素酶活性。每个细胞样品中加入100 μL萤火虫荧光素酶工作液检测萤火虫荧光素酶 (Firely lueiferase)，加入100 μL海肾荧光素酶工作液检测海肾荧光素酶 (Renilla lueiferase)，以萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶作为相对荧光素酶活性。实验重复3次。
Step3：检测荧光素酶活性
03 参考案例
案例二
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生物信息学进行LINC01082和miR-XX结合关系的分析，利用荧光素酶报告法验证miR-XX是LINC01082的直接靶点，人工合成LINC01082基因片段利用内切酶位点SpeI 和Hind III 引入pMIR-reporter (北京华越洋生物科技有限公司) 中，在LINC01082野生型上设计种子序列的互补序列突变位点，通过限制性内切酶酶切后使用T4 DNA 连接酶将目的片段插入到pMIR-reporter 报告质粒中。将测序正确的荧光素酶报告质粒WT和MUT分别与miR-XX共转染至细胞HEK-293T (上