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血清白球蛋白的分离、纯化及鉴定
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血清白球蛋白的分离、纯化及鉴定
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分离纯化的一般程序
选择材料
破碎细胞
提取
分离纯化
分析及鉴定
（粗分级，细分级）
（预处理）
实验目的
通过从血清中分离、纯化、鉴定血清白蛋白和γ-球蛋白的实验，培养学生综合应用盐析、离心、色谱、电泳分光等技术来分离纯化特定蛋白质的技能。
实验原理
1. 初分级: 血清经饱和硫酸铵盐析后获得白蛋白粗分离样品和球蛋白粗分离样品。
2. 脱盐:用凝胶色谱法除去分离样品中的盐类。
3. 细分级: 用离子交换色谱法从白蛋白粗分离样品中提取纯化的白蛋白；从球蛋白粗分离样品提取纯化的γ-球蛋白。
4. 鉴定: 用醋酸纤维薄膜电泳进行鉴定。
1. 盐 析
原理: 当高浓度盐存在时，蛋白质往往凝聚并析出沉淀。该技术为“盐析”。
不同的蛋白质在不同浓度的盐中形成沉淀。在半饱和硫酸铵溶液中，血清球蛋白会沉淀，经离心后，可与白蛋白分离开。
影响因素：PH、温度、蛋白质纯度等。
逐渐改变硫酸铵浓度可分段盐析出不同的蛋白。
操 作
操 作
一、盐析
－－ 白蛋白、γ球蛋白的粗分离
<1>
<2> (NH４)２SO４溶液，
缓慢滴入，边加边摇。
<3> 混匀后于室温中放置10分钟。
<4> 8000r/min×10min
<5> 小心吸取上清液，作为纯化白蛋白用。
<6> ，使之溶解，作为纯化 γ球蛋白用。
2. 脱 盐
盐析后的粗分离样品中含有硫酸铵离子成分， 样品中含有过高的离子浓度会影响离子交换层析的效果，所以在用离子交换层析进行细分级前需要脱盐。
凝胶色谱法是一个温和而又快速的脱盐方法，同时可将蛋白质转换到用于离子交换层析的低离子强度缓冲液中。
凝胶过滤的原理
洗脱液中蛋白质及盐分的检查
取96孔板一块，上四排加20％磺基水杨酸，下三排加BaCl2液。
从下端管口取1滴洗脱液，滴于20％磺基水杨酸中，出现白色混浊或沉淀即有蛋白质析出，开始收集蛋白样品。
从下端管口取1滴洗脱液，滴于BaCl2中，出现白色混浊或沉淀即有盐分析出，不再收集。
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AC-
AC-
AC-
AC-
AC-
AC-
NH4AC
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蛋白样品
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AC-
AC-
AC-
AC-
AC-
AC-
NH4+
NH4+
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NH4AC
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得到纯化的γ-球蛋白
得到纯化的白蛋白
γ-球蛋白带正电
白蛋白,α、β
球蛋白带负电
阴离子交换剂
三、纯化（阴离子交换层析）
将脱盐后含球蛋白的溶液加于DEAE纤维阴离子交换柱上， NH4Ac缓冲液洗脱，
分管收集洗脱液。检测到蛋白后立即收集三管，10滴/管，编号。（纯化的γ-球蛋白）
继续洗脱30ml
将脱盐后含白蛋白的溶液加于柱上， NH4Ac洗脱30ml 。（去掉α、β -球蛋白，午餐休息1小时）
NH4Ac洗脱，检测到蛋白后立即收集三管，15滴/管，编号。（纯化的白蛋白）
再生： NH4Ac 20ml， NH4Ac40ml
四、醋酸纤维素薄膜电泳检查
（1）血清
（2）粗分的γ-球蛋白液
（3）粗分的白蛋白液
（4）纯化的γ-球蛋白液：由于此溶液浓度较低，应多次点样于同一位置（2次），每次点样时待干后再点。
（5）纯化的白蛋白液
样品：
操作步骤：
１．准备与点样
2. 电泳 （点样面朝下，110V 1h）
３．氨基黑１０B染色
2cm
粗糙面