核酸和蛋白质分析技术.ppt

文档介绍：核酸和蛋白质分析技术
精选课件
第一节 核酸分析技术
讲述内容：
1、核酸电泳
2、杂交技术
3、PCR技术
4、基因芯片
精选课件
一、核 酸 电 泳
（一）DNA的凝
非放射性：生物素、***素、荧光素
2、标记方法
（1）切口平移法
（2）随机引物法
（3）末端标记法
（4）单链DNA探针标记
（5）寡核苷酸探针标记法
32P、35S和3H
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三 PCR技术
PCR (Polymerase chain reaction) 是用一对寡聚DNA作为引物，通过加温变性－退火－DNA合成这一周期的多次循环，使目的DN***段得到扩增。由于这种扩增产物是以指数形式积累的，经25－30个循环后，扩增倍数可达106。
Dr. Karry Mullis 1985年发明，获1993年度诺贝尔化学奖；
目的: 用于扩增位于两段已知序列之间的DNA区段。
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（一）原理：
双链DNA通过高温变性解离成互补单链DNA －－－变性
↓
与一对寡核苷酸引物（5’， 3’）降低温度退火
DNA加热变性+引物慢慢冷却使其结合，形象地称为退火
↓
适温延伸5’/3’引物形成新链变成4条链DNA －－延伸
↓
第二轮：变性—退火—延伸
呈指数增长
理论值：一轮一倍 10轮 103=1000倍
20轮 106
30 轮 109
理论 模板扩增30轮 1ng-----------1g
实际 模板扩增30轮 1ng-----------10g
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1 Taq DNA聚合酶：
水生栖热菌(thermus aquaticus,Taq)的DNA聚合酶
①5’3’DNA聚合酶活性；
②无3’5’外切酶活性，
%错配，与原始模板有差别；
最适聚合酶 温度72℃，选择72℃延伸
半衰期：℃ 130min
95℃ 40min
℃ 5—6min
变性温度：≤95℃使其在整个扩增循环中保持足够活性
（二）基本要素
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pfu DNA 聚合酶
耐热
5’3’DNA聚合酶活性
3’→5’外切酶活性
精确度：pfu >Taq
但pfu扩增效率通常比Taq酶略差
文献报道：Taq+pfu 会起到较好效果
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2 .引物
人工合成短寡核苷酸20bp-25bp→Tm=55℃-60℃，
Tm值要相近，每条10-50pmol /100l
◆设计原则：
（1）靠近5'上游Primer与双链DNA正链相同
3'下游Primer与双链DNA正链互补，与负链相同
正链5'————— 3' ——上游Primer
——下游Primer 负链 3'————— 5'
例如：
IL-3正链
5'GCTCCATGACCCAG----------- GCGATCTTTTGAGTCCAA 3'
负链3'CGCTAGAAAACTCAGGTT 5'
上游~： 与其相同
下游~： 先写出相应负链3'→5'然后倒过来5'→3'
所以负链Primer：5'-TTg gAC TCA AAA gAT CgC -3'
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（2）Primer 本身不要出现内部互补序列
形成loop环，内部二级结构
如： GGGTCGATTCCTACCCATGC
（3）注意减少Primer间互补序列
导