文档介绍：小规模制备质粒DNA的技术分析
一、实验目的
(1) 学习小规模制备质粒DNA的技术。
二、实验原理
质粒(Plasmid) ：
独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的遗传因子。是一种环状的双链DNA分子。
存在于葡萄糖是可缺的。
EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。
如果不加EDTA，其实也没什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕DNA会迅速被降解，因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA。
如果哪天你手上正好缺了溶液I，可不可以抽提质粒呢？
实话告诉你，只要用等体积的水，或LB培养基来悬浮菌体就可以了。
有一点不能忘的是，菌体一定要悬浮均匀，不能有结块。
溶液II
N的NaOH和2％的SDS等体积混合后使用的。
要用新从，无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。

破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。
细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致。
溶液II
为什么要加SDS呢？
那是为下一步操作做的铺垫。
这一步要记住两点：第一，时间不能过长，千万不要这时候去接电话，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组DNA也会断裂。
溶液III
加入后就会有大量的沉淀。
溶液III加入后的沉淀实际上是钾离子置换了SDS中的钠离子形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐，使得沉淀更完全。
大家知道SDS专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，
让人高兴的是大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀了。
因为基因组DNA太长了，长长的DNA自然容易被PDS给共沉淀了，尽管SDS并不与DNA分子结合。
溶液III
醋酸又是为什么而加的呢？
是为了中和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断DNA，所以要中和之。
基因组DNA一旦发生断裂，只要是50－100 kb大小的片断，就没有办法再被PDS共沉淀了。
溶液III
溶液III加入并混合均匀后在冰上放置，目的是为了PDS沉淀更充分一点。
不要以为PDS沉淀的形成就能将所有的蛋白质沉淀了，其实还有很多蛋白质不能被沉淀。
因此要用酚/氯仿/异戊醇进行抽提，
然后进行酒精沉淀才能得到质量稳定的质粒DNA，
不然时间一长就会因为混入的DNase而发生降解。
酚/氯仿
酚（Phenol）对蛋白质的变性作用远大于氯仿
水饱和酚的比重略比水重，碰到高浓度的盐溶液（比如4M的异硫氰酸胍），离心后酚相会跑到上层，不利于含质粒的水相的回收；
但加入氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始终在下层，方便水相的回收；
酚/氯仿
还有一点，酚与水有很大的互溶性，如果单独用酚抽提后会有大量的酚溶解到水相中，而酚会抑制很多酶反应（比如限制性酶切反应），
因此如果单独用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次将水相中的酚去除，而用酚/氯仿的混合液进行抽提，跑到水相中的酚则少得多，微量的酚在乙醇沉淀时就会被除干净而不必担心酶切等反应不能正常进行。
乙醇
回收后的水相含有足够多的盐，因此只要加入2倍体积的乙醇，在室温放置几分钟后离心就可以将质粒DNA沉淀出来。
如果感觉发生了盐的沉淀，就用70％的乙醇多洗几次，每次在室温放置一个小时以上，并用tip将沉淀打碎，就能得到好的样品。
RNase
得到的质粒样品一般用含RNase（50 ug/ml）的TE缓冲液进行溶解，不然大量未降解的RNA会干扰电泳结果的。
核酸电泳与感受态细胞的制备
实验目的
一、初步掌握琼脂糖凝胶电泳的方法及原理
二、掌握氯化钙法制备感受态细胞的方法
1 琼脂糖凝胶电泳技术
核酸分子是两性解离分子，在高于其等电点的电泳缓冲液中，其碱基不解离，而磷酸基团全部解离，核酸分子因而带负电荷，电泳时向正极迁移。琼脂糖主要从海洋植物琼脂中提取而来并经糖基化修饰，为一种聚合链线性分子，使用琼脂糖凝胶作为电泳支持介质，发挥分子筛功能，使得大小和构象不同的
核酸分子的迁移率出现较大差异，从而达到分离的目的。琼脂糖凝胶电泳操作简单、快速，通过调整其使用浓度，使得分辨率达到大多数实验的要求，因此成为分离、鉴定、纯化核酸分子的常用方法。