文档介绍：杭州师范大学本科生毕业设计（论文）开题报告
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杭 州 师 范 大 学
本科生毕业设计（论文）开题报告
题 目
Isl1lacZ/Isl2GFP两种用于分析Isl1/；
（2）解剖小鼠取视网膜、内耳、血液、心肌、皮肤等组织部分置EP管备用。
DNA提取
方法一：碱裂解法
（1） EP管
（2）加入100ul 50M NaOH
（10ml stock of 50mM NaOH= ddH20+50ul 10N NaOH）
（3）95℃加热10分钟，涡旋
（4）加入10ul 1M Tris（PH=），涡旋
（5）12000g离心5分钟
（6）加入100ul TE（PH=）
方法二：蛋白酶消化
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（1） EP管
（2）加入400ul Tail digestion buffer及2-5ul 10mg/ml proteinase K
（3）60℃加热，过夜
（4）加入200μl酚***仿异丙醇溶液，涡旋至乳白色，14000g离心5分钟
（5）吸取300ul上清液至新EP管，加入900ul 100%乙醇，摇动4-6次，
14000g离心1分钟
（6）倒去上清液，加入350ul 75%乙醇，14000g离心1分钟
（7）倒去上清液，自然风干
（8）加入50ul TE（PH=）
蛋白酶k是一种切割活性较广的丝氨酸蛋白酶，是枯草蛋白酶类的高活性蛋白酶，从林伯氏白色念球菌（tritirachium album limber）中纯化得到，用于生物样品中蛋白质的一般降解。
3、引物设计：
本次实验所用引物由美国罗切斯特大学甘霖教授完成。
4、基因片段PCR：
（1）高温变性（95℃）
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（2）低温退火（60℃）
（3）室温延伸（72℃）
5、琼脂糖凝胶电泳：
（1）配制1X TAE缓冲液（附录）
（2）制作琼脂糖凝胶：根据引物大小配制（600bp以下2%，%）
例：制作2%凝胶100ml
电子天平称取琼脂糖2g于锥形瓶中，加入100ml 1X TAE缓冲液（实际多于100ml，以免煮胶时蒸发升高凝胶浓度），锥形瓶加纸盖，摇匀，置微波炉中加热，直到凝胶溶液完全透亮，加入3ul genegreen核酸染料,摇匀。
（3）倒入已插入梳子的胶槽（中孔梳子薄面朝下）冷却。
（4）10-15分钟后将凝胶放入电泳槽中。
（5）用移液枪将PCR产物加到对应的胶孔中，每孔约7ul。
（6） 再将Marker（DM5000）加入其中一孔，约4ul。
（7）开始电泳，本实验用恒压电泳，一般为180V，跑至大约2CM即可停止。
（8）将跑完的凝胶放入凝胶成像仪 LAS-3000进行成像分析，使用核酸染料GelGreen程序。
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四、研究工作的步骤与进度（课题研究在时间和顺序上的安排）
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设计引物
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基因型鉴定
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2016