文档介绍：SDS-PAGE凝胶电泳
实 验 二
SDS-PAGE凝胶电泳
实验原理
实验步骤
注意事项
SDS-PAGE的优点
SDS-PAGE的缺点
实验常见问题及处理
小技巧
实验原理
源起
基本原理
分类
分离范围本产品分为还原型和非还原型两种，还原型上样缓冲液中的巯基可使蛋白分子的链内二硫键和链间二硫键断裂，使通过二硫键连接的各亚单位彼此分离，在电泳凝胶上显现多个蛋白条带，选购和使用时请务必注明，仔细区分。
上样缓冲液 之二
注意事项
还原型上样缓冲液中含一定量的DTT（二硫苏糖醇）或巯基乙醇，有轻微刺激性气味，较易区分；
  含巯基的试剂有一定的毒性，为了安全和健康，应穿实验服并戴一次性手套操作。
上样缓冲液 之三
使用说明  μl蛋白样品加入1μl蛋白上样缓冲液的比例，混合蛋白样品和蛋白上样缓冲液(5X)。     2. 100℃或沸水浴加热3～5min，以充分变性蛋白。     3. 冷却到室温后取上清直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。     4. 通常电泳时染料到达胶的底端附近（ ～1cm)即可停止电泳。
增加样品密度以保证蛋白质沉入加样孔内，一般上样缓冲液中加入一定浓度的甘油或蔗糖，这样可以增加样品的比重。
上样缓冲液中的甘油非常重要，起增加粘度的作用，这可以阻止样品从梳样孔中扩散出来到电泳缓冲液中。
指示剂检测电泳的行进过程，一般加入泳动速率较快的溴酚蓝指示电泳的前沿 。
上样缓冲液 之四
单纯的固定液一般难以达到这些要求，因此在实验中使用两种混和的固定液。Carnoy固定液（甲醇:冰乙酸=3:l）每次使用前需临时配制，长时间放置影响固定效果，固定时间15min至24 h，冰箱、室温均可。
甲醇/冰醋酸固定液
甲醇/冰醋酸固定液
甲醇：有固定、硬化和脱水的作用。可以固定白蛋白、球蛋白、核蛋白，但对核蛋白固定效果较差(亲和力小且易自溶)。甲醇固定的特点是杀死快，渗透力强，对组织收缩较大(可收缩20左右)，可使材料变硬。
冰醋酸：纯醋酸在温度稍变低时即形成冰晶，所以又称为冰醋酸。～的浓度作为固定液。冰醋酸对材料有膨胀作用，对核蛋白固定好，可与水、酒精、氯仿混合。
染色剂
考马斯亮蓝染色
常用染色方法 银染法
金属离子染色法
以考马斯亮蓝染色为例
考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。
考马斯亮蓝
考马斯亮蓝
考马斯亮蓝最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。该法是1976年Bradford建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1000μg／mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。
实验步骤
１．试剂配制
(1) 30%丙烯酰胺（Acr）：称Acr30g，甲叉双丙烯酰胺（Bis），加蒸馏水至100ml，过滤后置棕色瓶中。 4℃，1～2月 （2）10%SDS（十二烷基磺酸钠） （3） Tris-HCl缓冲液()：
称取Tris , 加入50ml水,用1mol/,最后用蒸馏水定容至100ml。
（4）-HCl缓冲液():
,加入50ml水，用1mol/,最后用蒸馏水定容至100ml
（5）-HCl缓冲液()：,加入50ml水，用1mol/,最后用蒸馏水定容至100ml
（６）TEMED（四甲基乙二胺）
（７）样品溶解液：
SDS（100mg）+巯基乙醇（）+ 溴酚蓝（2mg）+甘油（2g）+ -HCl（2ml），最后定容至10ml
（８）固定液：50%甲醇454ml，冰乙酸46ml混匀
（９）染色液：称取考马斯亮蓝R250 ，加上述固定液250ml，过滤后备用
（1０）脱色液：
冰乙酸75ml，甲醇50ml，加蒸馏水定容至1000ml
（1１）电极缓冲液