文档介绍：附件4
年
级:2009
学
号:0930506224
学院名称:生物化学工程学院
论文编号:
呼和浩特职业学院毕业论文（设计）
题
目:
蛋白质免疫沉淀的技术研究发展
专
业:
生物技术及应用
学生姓名：
是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；（3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。缺点为：（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质一蛋白质相互作用；（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；（3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。
实验方法流程
（1）转染后24-48h可收获细胞，加入适量细胞裂解缓冲液（含蛋白
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免疫共沉淀
酶抑制剂)，冰上裂解30min,细胞裂解液于4°C,最大转速离心30min后取上清；(2)
取少量裂解液以备Westernblot分析，剩余裂解液加1聘相应的抗体加入到细胞裂解液，4°C缓慢摇晃孵育过夜；(3)取10卩1proteinA琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液洗3次，每
次3,000rpm离心3min；(4)将预处理过的10卩1proteinA琼脂糖珠加入到和抗体孵
育过夜的细胞裂解液中4°C缓慢摇晃孵育2-4h，使抗体与proteinA琼脂糖珠偶连；(5)
免疫沉淀反应后，在4°C以3,000rpm速度离心3min,将琼脂糖珠离心至管底；将上清小心吸去，琼脂糖珠用lml裂解缓冲液洗3—4次；最后加入15卩1的2xSDS上样缓冲液，沸水煮5分钟；(6)SDS-PAGE,Westernblotting或质谱仪分析。注意的问题：
(1)细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质一蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂(NP40或TritonX-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定。不能用高浓度的变性剂(%SDS)，细胞裂解液中要加各种酶抑制剂，如商品化的cocktailer。(2)使用明确的抗体，可以将几种抗体共同使用(3)使用对照抗体：
单克隆抗体：正常小鼠的IgG或另一类单抗兔多克隆抗体：正常兔IgG
免疫沉淀技术的应用
利用免疫共沉淀技术验证抗增殖蛋白(PHB)与HSP70间的相互作用，为研究应激时HSP70促进PHB进入线粒体的机制提供科学依据。方法采用Westernblot方法检测HEK293细胞中PHB与HSP70的表达。构建抗增殖蛋白真核表达载体pEGFP-N1-PHB，经酶切鉴定正确后,将其转染HEK293细胞,采用荧光倒置显微镜观察转染效率。收集转染的HEK293细胞，利用免疫共沉淀技术验证PHB与HSP70之间的相互作用。结果在HEK293细胞中,HSP70具有较高的表达量，而PHB的表达量非常低。构建了抗增殖蛋白真核表达载体PEGFP-N1-PHB,转染HEK293细胞的效率达到90%以上。在抗体沉淀的PHB相互作用蛋白复合物中,可以检测到HSP70的存在。结论构建了抗增殖蛋白融合蛋白真核表达重组载体在HEK293细胞中高表达抗增殖蛋白后，利用免疫共沉淀技术证实PHB与HSP70之间存在相互作用。
未知蛋白HT036(HypotheticalproteinHT036)