文档介绍：淋球菌ng检测试剂盒的制作方法
专利名称：淋球菌ng检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明提供一种淋球菌(NG)检测试剂盒，具体是一种基于荧光PCR的NG-DNA检测试剂盒。
背景技术：
奈瑟淋球菌(Neisseria gonoG-DNA的试剂盒应用于临床检测中，但这些试剂盒多半以煮沸法提取核酸，且其检测灵敏度不高，约在50(Tl000COpies/ml左右；另外，这些试剂盒大多缺乏完善的质控体系，还需要进一步完善和提高技术水平，使此类产品更加满足临床准确诊断的需要。
发明内容
本发明提供一种核酸释放剂在淋球菌NG检测中的应用，所述核酸释放剂包含莎梵婷(surfactin) O. OI O. 5mM/L,***化钾
20^300mM/L,十二烷基磺酸钠O. OI 2%和乙醇
1%。在本发明所述核酸释放剂中，其溶剂可以为本领域常用的，例如为无菌水或TE缓冲液。本发明首次披露在淋球菌NG检测中使用含强蛋白变性剂的核酸释放剂，在很大程度上简化了该核酸检测的步骤，而且检测灵敏度有了很大的提高。本发明提供一种淋球菌NG检测试剂盒，所述试剂盒中包括核酸释放剂和PCR反应液，所述核酸释放剂包含莎梵婷(surfactin) O. θΓθ. 5mM/L，***化钾2(T300mM/L，十二烷基磺酸钠O. 0Γ2%和乙醇O. 05^1% ;所述PCR反应液中包含用于靶多核苷酸扩增的上游引物、下游弓I物和用于靶多核苷酸检测的探针。使用本发明试剂盒中的核酸释放剂释放核酸的方法与煮沸法提取核酸的检测结果没有明显差异，而本发明中提取核酸时采用强烈的蛋白变性剂，快速破坏病原体外壳蛋白结构，释放出病原体核酸，无需加热即可完成DNA的释放和提取；本发明试剂盒检测淋球菌NG的灵敏度可达400copies/ml，检测线性范围为400 4. 00E+10copies/ml。具体地，用于靶多核苷酸的探针序列为5’ -CCTAGCAAGCTCCACAGATAGGGCTTG-3’;优选用于靶多核苷酸的上游引物和下游引物的序列分别为5’ -CTATCAACCCTGCCGCCG-3’和5’ -CCCGGCAGTTACGCATGAG-3’。本发明的试剂盒因采用用于检测靶多核苷酸的上述引物和/或探针序列，具有很好的特异性。本发明中，优选所述试剂盒中还包括内标，所述内标的序列为5’_GTGTCTGCGGCGTTTTATCATCTTCCTCTGTCATCCAGTGCAAGTCTTGATCCTGTCGTTGGTTCTTCTGGACTATCAAGGTATGTTGCCCGTTTGT-3’。本发明中所述内标为插入PUC18T载体的一段长为97碱基对的人工合成DNA序列的重组体，即质粒，它作为PCR扩增体系中的阳性内对照，预防由于样本中可能存在的PCR干扰物质导致的假阴性。在所述试剂盒中包含内标的情况下，所述PCR反应液中还包括用于内标检测的上游引物、下游引物和探针；且优选内标探针的序列为5’ -TCATCCAGTGCAAGTCTTGATCCTGTC-3’ 。优选本发明所述试剂盒中还包括酶混合液，所述酶混合液中包含耐热DNA聚合酶(Taq酶)和O. 5^2U/ μ I的尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)，同时在所述PCR反应液中还包含dUTP。其中UNG酶的功能是降解含有dU的PCR产物，利用U