文档介绍：第三章基因工程制药第一节概述?意义:自 20世界 70年代基因工程诞生以来,最先应用基因工程技术且目前最为活跃的研究领域便是医药科学。基因工程技术的迅猛发展使人们已能够十分方便有效地生产许多以往难以大量获得的生物活性物质,甚至可以创造出自然界中不存在的全新物质。 1982 年第一个基因重组产品——人胰岛素在美国问世,吸引和激励了大批科学家利用基因工程技术研制新药品,迄今累计已有近 30种基因工程药物投入市场,产生了巨大的社会效益和经济效益。?基因工程技术可生产的药物和制剂包括: ?(1)免疫性蛋白,如各种抗原和单克隆抗体; ?(2)细胞因子,如各种干扰素、白细胞介素、集落刺激生长因子、表皮生长因子、凝血因子; ?(3)激素,如胰岛素、生长激素、心素纳; ?(4)酶类,如尿激酶、链激酶、葡激酶、组织型纤维蛋白溶酶原激活剂、超氧化物歧化酶。?基因工程技术生产药物的优点: ?(1)利用基因工程技术可大量生产过去难以获得的生理活性蛋白质和多肽,为临床使用提供有效保障; ?(2)可以提供足够数量的生理活性物质,以便对其生理、生化和结构进行深入的研究,从而扩大这些物质的引用范围; ?(3)利用基因工程技术可以发现,挖掘更多的内源性生理活性物质; ?(4)内源生理活性物质在作为药物使用存放的不足之处,可以通过基因工程和蛋白质工程进行改造和去; ?(5)利用基因工程技术可获得新型化合物,扩大药物筛选来源。?我国基因工程药物研究和开发:起步较晚,基础较差。α1b 型基因工程干扰素是由我的生物高科技成果,于 1997 年通过Ⅲ期临床,并获得国家一类新药证书,成为“ 863 ”计划生物技术领域第一个实现产业化的基因工程药物。目前我国已批准 12种基因工程药物和疫苗上市,在研究开发中的也有 10余种。第二节基因工程药物生产的基本过程?定义:基因工程技术是指将重组对象的目的基因插入载体,拼接后转入新的宿主细胞,构建成工程菌(或细胞),实现遗传物质的重新组合,并使目的基因再工程菌内进行复制和表达。?基因工程药物制造的一般流程: ?(1)获得目的基因;( 2)组建重组质粒;( 3)构建基因工程菌; (4)培养工程菌;( 5)产物分离纯化;( 6)除菌过滤;( 7)半成品检定;( 8)包装。?1、上游阶段:首先获得目的基因,然后用限制性内切酶和连接酶将其插入适当的载体质粒或噬菌体中并转大肠杆菌或其它宿主菌(细胞),以便大量复制目的基因。选择基因表达系统主要考虑的是保证表达功能,其次要考虑的是表达量的多少和分离纯化的难易。其中的( 1)、( 2)、( 3)步骤属于上游阶段,在实验室完成。?2、下游阶段:将实验室成果产业化、商品化,它主要包括工程菌大规模发酵最佳参数大的确立,新型生物反应器的研制,高效分离介质及装置的开发, 分离纯化的优化控制,高纯度纯品的制备技术,生物传感器等一系列仪器仪表的设计和制造,电子计算机的优化控制等。上述( 4)、( 5)、( 6)、(7)、( 8)等属于下游阶段。第三节目的基因的获得?一、逆转录法?逆转录法是先分离纯化目的基因的 mRNA ,再反转录成 cDNA ,然后进行 cDNA 的克隆表达。?1、 mRNA 的纯化? mRNA 的特点: 3’末端含有一多聚腺苷酸组成的末端。?方法:亲和层析法?2、 cDNA 第一链的合成?一般 mRNA 都带有 3’- polyA ,所以可以用寡聚 dT作为引物, 在逆转录酶的催化下,开始 cDNA 链的合成。?用放射性探针法检测。?3、 cDNA 第二链的合成?以 cDNA 第一链为模板合成第二链。?4、 cDNA 克隆?用于 cDNA 克隆的载体有两类:质粒 DNA 和噬菌体。又将其分为表达型载体和非表达型载体。选用表达型载体可以增加目的基因的筛选方法,有利于目的基因的筛选。? cDNA 片段与载体的连接通常采用下面方法: ?加同聚尾连接:在载体和 cDNA 的3’末端加上互补的同型多聚酶序列。?人工接头连接:所谓人工接头是指用人工合成的、连接在目的基因两端的含有某些限制酶切点的寡核苷酸片断。?5、将重组体导入宿主细胞?6、 cDNA 文库的鉴定?7、目的 cDNA 克隆的分离和鉴定?(1)核酸探针杂交法?(2)免疫反应鉴定法?逆转录-聚合酶反应法。该方法是 mRNA 经逆转录合成 cDNA 第一链,不需再合成第二链,而是在特异引物的协助下,用 PCR 法进行扩增,特异地合成目的 cDNA 链, 用于重组,克隆。?二、化学合成法?前提:较小的蛋白质或多肽的编码基因,必须知道目的基因的核苷酸排列顺序,或知道目的蛋白质的氨基酸顺序,再按相应的密码子推导出 DNA 的碱基序列。