文档介绍：放射免疫荧光标记免疫详解演示文稿
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优选放射免疫荧光标记免疫
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免疫标记技术=
抗原抗体反应
示踪物标记
灵敏度
特异性
免疫标记技术的主要特点：
高特异性、高灵Ag*
从标准曲线上读知含量
测定Ag*-Ab和游离Ag*放射性
放射免疫测定法(RIA)示意图
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放射免疫技术基本类型
液相法
平衡法（一步法）
顺序加样法
固相法
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免疫放射分析技术（immunoradiometric assay，IRMA）
1968年，Miles 和Hales应用同位素标记胰岛素抗体，成功检测牛血清中的胰岛素。
Type
IRMA
RIA
被标记物质
抗体
抗原
抗体用量
过量
限量
被检抗原相对分子量
相对较大
相对较小
反应方式
分步结合
竞争结合
B、F分离方法
固相洗涤分离
液相沉淀/吸附分离
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免疫放射技术基本条件
标记抗体的制备
抗体亲和力要求不高
固相抗原免疫吸附剂
对抗原吸附力强，对非特异性蛋白吸附少，结合过程中高度分散（重氮化纤维素，琼脂糖4B珠）
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免疫放射技术基本类型
经典IRMA）
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双抗夹心法
免疫放射技术基本类型
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放射免疫分析技术的灵敏度高、特异性强、精密度好, 常用于各种激素、微量蛋白质、肿瘤标志物和药物等微量物质的测定。但由于放射污染和危害，常用核素半衰期短，试剂盒稳定期不长等诸多不足, RIA将逐渐被取代。
放射免疫分析技术的应用
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荧光免疫技术
Immunofluorescence technique， IFA
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Introduction:
1958年，Riggs等合成了异硫***酸荧光黄（fluorescent isothiocyanate，FITC）；Marshall对荧光标记方法进行了改进，荧光技术逐渐推广
1942年，Coons等，异硫***酸荧光素标记抗体，检测小鼠组织切片中可溶性肺炎链球菌多糖抗原
IFA
荧光素
敏感可测
抗原抗体反应
特异性
显微技术
高度精确
优点：特异性强，敏感性高，速度快，结果直观---病原微生物
缺点：荧光标本保存难（淬灭）
非特异性染色
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荧光素具有共轭双键体系的化学结构
通常处于最低能量状态---基态
激发光（紫外光）照射，跃迁到激发态
回到基态，释放光子能量（波长较长的可见光
---荧光）
荧光免疫分析（IFA）技术原理
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荧光免疫分析（IFA）技术原理
Y
Y
Y
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一种有机或无机化学物质，其接受激发光后，能够以发射光形式产生明亮的荧光而作为染料使用。
各种荧光素都有各自的激发波长和发射波长。因发射波长不同而颜色不同。
异硫***酸荧光黄（FITC），四乙基罗丹明（Rb200），藻红蛋白（PE）。
荧光免疫分析（IFA）基本条件
1. 荧光素
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较高较稳定的荧光效率
具有能与蛋白质分子形成稳定共价键的化学基团
与蛋白质结合简单快速
结合产物的荧光颜色与实验对象的自发荧光对比鲜明
结合物具有一定的耐贮藏性
标记用荧光素应具备的条件
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抗体：特异性强、效价高、标记后活性高
标记前：梅花状双扩测效价
标记抗体种类：多克隆抗体、单克隆抗体、葡萄球菌A蛋白（荧光二抗通用试剂）
2. 待标记抗体
1mg/mL
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FITC（异硫***酸荧光黄）标记抗体Marsshall法原理当FITC在碱性溶液中与抗体反应时，主要是抗体分子上的赖氨酸-氨基与FITC上硫碳***键结合，一个IgG分子中有86个赖氨酸残基，一般最多能结合15～20个。
3. 荧光标记抗体制备与纯化
荧光素- FITC- N＝C ＋ N - 蛋白质 FITC- N – C – N - 蛋白质
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S H H H S