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生化实验报告
实验一过氧化物酶同工酶的分离提取
一、实验目的
1、初步掌握蛋白质分离纯化的一测定过氧化物酶活性原理与方法。
二、实验原理
在过氧化物酶的催化下，H2O2将愈创木酚氧化成茶褐色产物。此产物在470nm处有最大吸收值，故可通过测定470nm处的吸光值的变化可以测定过氧化物酶的活性。
三、实验材料、试剂和仪器设备
（一）材料菠菜叶片（或苜蓿种子）
（二）仪器设备
722型分光光度计烧杯量筒移液管试管研钵离心机
1. （三）试剂pH5・50,05MPBS;;2%H2O2；20%的三***乙酸。
四、实验步骤样品液：以实验一的3、5、6步（稀释10倍后）中低温保存的酶样液进行测定・过氧化物酶活性测定按以下表格依次加入各试剂。
表测活体系中各试剂加入量
年口样心样对照管号［,、（ml）…/（ml）
2%H2O2（ml）（ml）
（灭活酶液）
37C保温15min,迅速冰浴20%三***乙酸（ml）2222
然后离心5000g10min取清液，适当稀释后，470nm处测吸光值。
五、
物酶活性单位（u）[U
过氧化物腾活性二式中：△A470为反应时间内吸光值的变化；
W为所称样品重，g;t为反应时间，min;Vt为提取酶液总体积，ml;Vs为测定时取用酶液体积，ml。
样1
样2
样3
测得的OD值
「
酶活性
（U/g）
实验四葡聚糖凝胶过滤分离蛋白质一、实验目的：
学会用凝胶过滤层析分离物质的基本操作，深刻理解其分离物质的原理。
二、实验原理：
凝胶过滤层析利用有一定孔径的多孔的亲水性凝胶作为载体，当分子大小不同的混合物通过这种凝胶柱时，各物质在柱中存在两种运动？一是施洗觥液垂菁向下移动，二是羌定向的扩散运动。直径大于凝胶孔径的大分子，不能进人胶粒内部，便直接沿着胶粒间隙溶剂先流出，称为全排出)；小分子物质，直径小于凝胶孔^径，能自由进出能容纳下它们的孔穴，绕道而行，结果在柱中的保留时间增长而最后流出；中等大小的分子，能进人部分胶粒内部，从而在柱中的保留时间较大分于长，但较小分子短，中间流出。于是，流奇凝胶柱的j昆合物猿其分子大小W被分离。
混合物中芸一被分离成分在一定的凝胶层析柱内的洗脱行为，通常用分配系数(Kd)来表示。其定义为，Kd=(Ve一V0)/ViVe,某一被分离物成分决族脱时所用洗脱液的体Vo,凝胶颗粒间自由空间的总体积，Vi,胶颗粒内部孔穴的总容积
大分子物质，其Kd=0?小分子能全部进人胶粒内的Kd=1,中等大小分子，Kd在O〜1三凝廊滤法韵分辨卒(&)是凝胶折中的另一个王要辑征常竣。从数学鬲度上可以表示为,p=2（V2—V1）/（W1+W2）（H）
V2、V1,是两种被分离物的洗脱体积W1、W2乙是两个物质的洗脱峰的宽度。两会相的物质要旗完全分离，p凯三、质而戒剂及器材：
胰蛋白酶（分子量为23KD）和牛血清白蛋白（分子量68KD）混合物、蛋白marker、层析柱50cnt<、核蛋检测仪、部分收窠器、sephadexG一150四、实验步骤:
：取干燥的SephadexG—100浸泡在洗脱液（本实验用蒸偕水，含5%的乙醇）中，充分溶胀，注意不要过分括拌，以防颗粒破碎。为了缩短溶胀时间，可在沸水浴上加热至将近1OOC30min,还可以排除凝胶内部的汽泡（学生自己做）。
：将柱子及其附件清洗干净先将下口接好，加上缓冲液，将出口处的汽泡排除，待柱内剩有2cm左右液柱时，关紧流出口，将己溶胀好的凝胶的上清液吸去，轻轻搅拌凝胶顺层析柱或玻璃棒一次性倾倒入层析柱，待底部自然沉降有一定凝胶后，打开流出口，直至凝胶沉积至所需高度。加盖，并接上贮液瓶，开始滴注洗脱平衡液（本实验用蒸储水，含5%勺乙醇）。至少要滴注2个柱床体积的洗液，使胶床稳定。并检查柱子装得是否均匀、有无断层，有无汽泡（若有需重装）。
1. 上样：①用蒸偕水溶解胰蛋白酶（分子量
为23KD）60mg和牛血清白蛋白（分子量68KD）20mg混合物用1mlH2O溶解。上样0・5ml.
…、…②眼木桂床上的游液『（或自留流出），直至胶面刚露出为止，夹住下出口，