文档介绍：（DNApolymerase I ）最早于1955年发现，而较具有实验价值及实用性的Klenow
fragment of E. Coli 则是于70年代的初期由 Dr. H. Klenow 所发现，但由于此酶不耐高 温，高温能使之变性，因列互补。
引物设计的基本原则
①引物长度：15-30bp ,常用为 20bp左右。
②引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。
ATGC最好随机分布，避免5个以上的嗯吟或的成串排列。
③引物内部不应出现互补序列。
④两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3 '端的互补重叠。
⑤引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%,引物3'末端连续 8个碱基在待扩增区
以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。
⑥引物3 '端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，最佳选择是G和Co
⑦引物的5 '端可以修饰。如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地高 辛标记，加入其它短序列，包括起始密码子、终止密码子等。
v引物设计软件
Primer （自动搜索）*
vOligo6 （引物评价）
vVector NTI Suit
vDNAsis
vOmiga
vDNAstar
vPrimer3 (在线服务)
3、模板的制备
PCR的模板可以是 DNA,也可以是 RNA
模板的取材主要依据PCR的扩增对象，可以是病原体标本如病毒、细菌、真菌等。也可以是
病理生理标本如细胞、血液、羊水细胞等。法医学标本有血斑、精斑、毛发等。
标本处理的基本要求是除去杂质，并部分纯化标本中的核酸。多数样品需要经过SDS和蛋白
酶K处理。难以破碎的细菌，可用溶菌酶加EDTA处理。所得到的粗制DNA经酚、***仿抽提纯化，
再用乙醇沉淀后用作PCR反应模板。
4、PCR反应条件的控制
①PCR反应的缓冲液提供合适的酸碱度与某些离子
②镁离子浓度总量应比dNTPs的浓度高，常用L
③底物浓度 dNTP以等摩尔浓度配制，20〜200umol/L
④TaqDNA 聚合酶 (100ul )
⑤引物浓度一般为 〜L
⑥反应温度和循环次数
变性温度和时间95 ℃, 30s
退火温度和时间低于引物Tm值5 c左右，一般在 45〜55c
延伸温度和时间72 ℃, 1min/kb (10kb内)
Tm 值=4(G+C) +2(A+T)
循环次数：一般为25〜30次。循环数决定 PCR扩增的产量。模板初始浓度低，可增加循环
数以便达到有效的扩增量。但循环数并不是可以无限增加的。一般循环数为30个左右，循环数
超过30个以后，DNA聚合酶活性逐渐达到饱和，产物的量不再随循环数的增加而增加，出现了所 谓的“平台期”。
[PCR步骤]
标准的PCR过程分为三步：
变性
(90C-96C):双链 DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA
.退火
(25C-65C):系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。
(70C-75 C):在(在 72 c左右，活性最佳)的作用下，以dNTP为原料，从引物的 5'端
-3'端延伸，合成与模板互补的DNA链。
每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量即