文档介绍：一种用于bace1抑制剂筛选的电化学方法
专利名称：一种用于bace1抑制剂筛选的电化学方法
技术领域：
本发明涉及一种用于BACEl抑制剂筛选的电化学方法，属于药物筛选领域。
背景技术：
阿尔茨海默病(Alzheimer’ s 的水溶液中进行。所述的待筛选的BACEl抑制剂只与BACEl作用，而不与多肽底物作用。本发明在抑制酶切反应之前，先进行BACEl的酶切反应，对BACEl进行酶切反应时的浓度、温度和时间等条件的优选；浓度优选为5 15nM ;温度优选为37 °C ;时间优选为30 90mino本发明巯基二茂铁修饰的纳米金/抗生物素蛋白复合物的具体制备方法是:(I)用移液枪移取 μ L HS- (CH2) 6Fc (或者称取 )至 600 800 μ L 正己烷中，超声溶解；(2)采用PBS (pH为7 )将IOOyL纳米金(直径约IOnm)/抗生物素蛋白复合物稀释到200 μ L ;(3)将步骤(I)和(2)所得溶液混合，置于圆周振荡摇床上，在800 1200rps的转速下摇动20 28h ；(4)离心弃去正己烷有机相和未反应的水相，从而得到二茂铁修
饰的纳米金-抗生物素蛋白复合物；(5)所得到的纳米金复合物用正己烷淋洗两次，放在冰箱中(O 4°C )保存备用。本发明筛选BACEl抑制剂的具体方法是:
(I)将金电极浸泡在50μ L浓度为ΙμΜ生物素标记的多肽(序列为Bition-KTEEISEVN LDA EFRHDKC)溶液中，8 12h后，用二次蒸馏水多次冲洗，用N2吹干；(2)将步骤(I) (用量约50μ L)的HT封闭4 lOmin，然后用二次蒸馏水冲洗干净，N2吹干；(3)在步骤(2)的基础上再采用1% (用量约50μ L)
，然后用二次蒸馏水冲洗干净，N2吹干；(4)酶切反应和抑制酶切反应分两组实验依次进行:(a)酶切反应:(I)将多根(至少3根)上述步骤(3)封闭后的金电极分别浸泡在50 μ L浓度为IOnM的BACEl溶液中；置于37°C环境中，反应时间在O 120min之间，将金电极用二次蒸馏水冲洗干净，N2吹干；(II)将10 μ L 二茂铁修饰的纳米金/抗生物素蛋白复合物滴加到步骤(I)得到的每根金电极的表面，20 60min后用二次蒸馏水冲洗干净，N2吹干；(III) KClO4水溶液中进行电化学检测；优选出BACEl的最佳酶切反应反应时间30 90min ；(IV)重复(I) (III)步骤，将(I)中的浸泡时间在30 90min内选择，BACEl的浓度在O 20nM之间，其它条件不变；优选出BACEl的最佳酶切反应所需浓度为5 15nM ；(b)抑制酶切反应:(i)将多根(至少3根)上述(3)封闭后的金电极浸泡在不同浓度的待筛选的BACEl抑制剂和浓度为5 15nM BACEl的混合液中；置于37°C的环境中反应30 90min，再将各金电极用二次蒸馏水冲洗干净，N2吹干； ( i i )将10 μ L 二茂铁修饰的纳米金/抗生物素蛋白复合物滴加到步骤(i )所得到的每根金电极表面，反应20 60min，然后用二次蒸馏水冲洗干净，N2吹干；(iii)最后将组装好的