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生物技术制药
第一章绪论
★生物技术与生物技术药物的概念
生物技术药物的分类
+按用途分类：治疗药物、预防药物、作为诊断药物(免疫诊断试剂、酶诊断试剂、器官功能诊断药物、放
射性核素诊断药物、诊断用单克隆抗体菌体载体：插入型载体、置换载体
・来源于噬菌体DNA，因可以插入较大DNA片段，常用于构建基因组文库和cDNA文库。
＞目的基因的常用制备方法
♦化学合成法：前提：基因的DNA的序列已知。小于100bp的片段：直接合成，最常用固相亚磷酸三酯法。大片段目的基因：小片段粘接法、大片段酶促法
PCR法：前提：已知待扩增目的基因或DNA片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必需的双引物。
♦基因文库法：鸟枪法：适用于原核细菌目的基因的克隆分离
cDNA文库法(与mRNA互补的DNA)并非所有的mRNA分子都具有polyA结构；仅限于克隆蛋白质编
码基因；mRNA含量少且t1/2短，对酶和碱极为敏感，分离纯化困难
第一链：mRNA模板，引物(polyT)，逆转录酶，dNTPs
第二链：自身引导法：取得的双链CDNA5'端会有几对碱基缺失(NaOH，煮沸；Klenow酶，dNTPs;
S1内切酶)引导合成法：获得的cDNA能保持完整的5'端序列(TdT,Dctp;NaOH;退火；Klenow酶,dNTPs)
♦基因文库的完备性：指在构建的基因文库中任一基因存在的概率，它与基因文库最低所含克隆数N之间的关系可用下式表示：N=ln(1-P)/ln(1-f)，P=完备性，f=克隆片段的平均大小/生物基因组的大小
♦双酶切产生的粘性末端，最常用，可以确保连接方向的正确性
♦影响连接效率的因素：连接方式；目的基因与载体的浓度比例摩尔数比大于1；连接温度、时间、酶的活性、反应缓冲体系
＞重组DNA导入宿主细胞
♦导入大肠杆菌：CaCl2法；转染法
♦导入酵母：电转化法；化学转化法；原生质转化法
导入链霉菌：原生质转化法；电穿孔法
♦重组DNA导入哺乳动物细胞：显微注射法；DEAE葡聚糖转染法；DNA-磷酸钙转染法；阳性脂质体介导法；电穿孔法；细胞融合法；病毒感染法
＞重组子的筛选与鉴定
♦遗传标记筛选法：抗生素抗性筛选法；a互补筛选法(蓝白斑筛选一一载体含有LacZa基因，X-gal培养基，成功导入的菌落显示为蓝斑)；营养缺陷型筛选法；噬菌斑筛选法
♦核酸分子杂交法：菌落原位杂交法；DNA印迹法；RNA印迹法
♦限制性内切酶图谱法：琼脂糖凝胶电泳鉴定各片段分子量，含有目的基因的为阳性克隆
+DNA序列测定法
+目的基因表达产物测定法
原核细胞表达的特点及选择
来源：网络转载
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+大肠杆菌（首选，遗传背景研究清楚；适合大规模生产（成本低，周期短，效率高，操作简单）、芽抱杆菌、链霉菌等
+缺点：缺乏翻译后修饰系统；容易以包涵体形式存在；外源蛋白容易被宿主酶系统水解
★外源基因表达的调控原件：复制子、启动子（表达效率的关键因素和终止子、核糖体结合位点（即SD序列及SD序列到起始密码子AUG的距离）、识别翻译后修饰信号
+用于原核表达的载体必须具备的条件：具有复制子、灵活的克隆位点和方便的选择标记、很强的启动子、阻遏子（一般有）、强的终止子，所产生的mRNA应具有翻译起始信号（起始密码子AUG以及SD序列）
★外源基因在大肠杆菌中的表达方式
+胞内表达：
非融合蛋白表达：蛋白质接近天然状态，易被降解，易形成包涵体。有原核多肽基因
融合蛋白表达：表达效率高；产物稳定；可以切除原核多肽，获得天然外源蛋白
+分泌表达：有信号肽基因，形成周质表达或细胞外表达
★外源蛋白表达效率的影响因素
+外源基因密码子：大肠杆菌具有偏好密码子和稀有密码子，外源基因应尽量设计成为大肠杆菌的偏好密码子
+mRNA的结构：改变一级结构；降低5'端二级结构稳定性；调控3'端非翻译区二级结构
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+表达载体的选择：表达方式；强的复制子（拷贝数高）；强的启动子（转录效率高）；高效
率的核糖体结合位点；强的终止子（提高mRNA稳定性）；适应范围广；稳定性高；产物易纯化。
+夕卜源蛋白的稳定性：采用融合蛋白形式表达；采用蛋白酶缺陷的突变菌株
真核细胞表达的特点及选择
＞常用的真核表达系统:酵母表达系统、昆虫细胞表达系统、哺乳动物细胞表达系统
大肠杆菌和酵母表达系统的比较
大肠杆菌
巴斯德毕赤酵母
载体
原核载体
穿梭载体i
调控序列
原核
原核和真核
—表达形式
包涵体、融合蛋白、分泌
分泌|
翻译后修饰
基本无
有1
生产方式
发酵，操作简单、经济
发酵，操作较简