文档介绍：miR-15b-5p对大鼠的胰腺外分泌细胞AR42J凋亡的影响
 
 
王福贵 王小蝶 余维丽 孙昀
Summary 目的 研究小的非编码RNA（miRNAs）miR-15b-5p℃、5s。合成cDNA以预备使用。按照表1中所示引物序列，采用荧光定量PCR扩增仪，根据以下要求完成荧光定量PCR反应，即95℃、30s预变性;95℃、5s，60℃、20s，共四十个循環;95℃、1s，60℃、15s，95℃、5s，在反应结束后，以 U6基因为内参照，计算miR-15b-5p相对表达含量，见图1。
转染成功后，用雨蛙素（100 nmol/L）刺激24 h，诱导好的细胞可以进行后续实验。实验分为6组，分别记为：空白对照组（不做任何处理的AR42J细胞）、雨蛙素组、 雨蛙素+miR-15b-5p mimics NC组 、 雨蛙素+miR-15b-5p mimics组、雨蛙素+miR-15b-5p inhibitor NC组、雨蛙素+miR-15b-5p inhibitor组。再次测定各组细胞中miR-15b-5p miRNA相对表达水平，计算miR-15b-5p相对表达含量，见图2。
qRT-PCR测定各组细胞中细胞凋亡相关基因Caspase-3和Caspase-9 相对mRNA相对表达水平
取出转染并造模后的各组细胞，使用TRIzol試剂提取出细胞中的全部RNA。用紫外线分光光度计检测RNA浓度和纯度，合格后进行逆转录，合成cDNA以预备使用。按照表2中所示引物序列，采用荧光定量PCR扩增仪根据以下要求完成荧光定量PCR反应，即95℃、30s预变性;95℃、5s，60℃、20s，共四十个循环;95℃、1s，60℃、15s，95℃、5s，在反应结束后，以β-actin基因为内参照，计算Caspase-3及Caspase-9的mRNA相对表达含量。见图3。
blot法测定细胞中细胞凋亡关键蛋白Caspase-3和Caspase-9的相对表达水平
取出之前处理好的各组细胞，使用RIPA裂解液裂解细胞，同时予以蛋白酶抑制剂抑制蛋白降解，获得总蛋白质后，用BCA检测试剂盒完成蛋白定量分析。之后进行凝胶电泳及对应蛋白分子的转膜。转膜后，在含5%脱脂奶粉的TBST溶液中，慢摇并于室内温度下封闭PVDF膜约2 h，再用TBST溶液洗涤浸泡3x10 min。在相对应的一抗抗体中4℃孵育过夜。第二天再用TBST冲洗3x10 min，然后在相对应的二抗中孵育条带1 h左右，最后再用TBST冲洗3x10 min。然后用ECL化学发光底物显影检测对应的蛋白质，最后用Image-J处理图像，以β-Actin为内参计算其蛋白质相对表达量。
取已处理好的所有组细胞，加入胰酶（不含EDTA）适度消化，吹离细胞后，予以500 g离心力离心5 min，将细胞收集，并吸去上清，加入1 ml PBS溶液再次洗涤细胞，然后将加入PBS溶液的细胞于500 g离心力下离心5 min，再次吸去上清，再加入400 μl Binding Buffer吹匀细胞，每组加入5 μl 的Annexin V-FITC试剂，在室温下静置约15 min，再加入10 μl的PI试剂，避
光冰浴静置5 min。在30 min内，使用CytoFLEX流式细胞仪进行凋亡状况测定，并用CytEepert软件进行解析。
，数据以±s表示，两组均数采用t检验比较，多组数据之间采用方差分析比较。所有数据至少进行三次独立实验。P值< 。
-15b-5p miRNA相对表达水平
与空白对照组相比较，miR-15b-5p mimics NC组 、miR-15b-5p inhibitor NC组中的miR-15b-5p miRNA相对表达水平无统计学意义;与miR-15b-5p mimics NC组相比，miR-15b-5p mimics组中的miR-15b-5p miRNA相对表达水平增高（F=，P<）;反之，miR-15b-5p inhibitor NC组相比，miR-15b-5p inhibitor组中的miR-15b-5p miRNA相对表达水平降低（F=，P<），见图1。说明转染成功。
-15b-5p miRNA相对表达水平
与空白对照组相比较，雨蛙素组中的miR-15b-5p miRNA表达水平增高（F=，P<）;雨蛙素组、雨蛙素+miR-15b-5p mim