文档介绍：蛋白质的研究方法
生物化学教研室
2010-10
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主要内容
蛋白质对象的选择和样品的获取
蛋白质的检测和鉴定
蛋白质的结构分析
蛋白质生物功能检测
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蛋白质对象的选择和样 亲水性头部
疏性尾巴 的双亲性（amphipathic）脂类分子
作用：
既可以破坏细胞的磷脂双层结构，又可以与具有疏水性表面的膜蛋白结合，从而阻止释放出来的膜蛋白通过疏水相互作用形成大的、可沉淀的聚集体。
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有的去污剂的亲水性头部可离子化（即含有一带电基团）
如：
脱氧胆酸钠（sodium deoxycholate）
十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate，SDS）
有的去污剂不能解离，所以分子中缺少带电基团， 如：
Triton X-100，
辛基葡萄糖苷( octylglucoside）
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临界微团浓度（critical micelle concentration，CMC)：
每一种去污剂都具有一特征性的CMC。
CMC值与其分子中疏水部分与亲水部分的结构有 关。
当[去污剂]低于此值的时候，去污剂分子在水溶液中将不形成微团，达到此值的时候，微团开始形成。
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离子化去污剂（SDS）：
其“疏水尾巴”破坏蛋白质分子的疏水性部分的结构，其带电的“头部”破坏蛋白质分子中的氢键和离子键。
作用的结果是：
使任何蛋白（不管是膜蛋白还是水溶性蛋白）都发生完全变性，并溶解在水溶液中，同时失去生物活性。
在部分情况下，当去污剂被透析掉后，蛋白质可以复性并恢复生物活性。
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SDS-聚丙烯酰***凝胶电泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）：
就是利用SDS的这种结合在整个蛋白分子上，并使蛋白完全变性的特性。
这样经过SDS变性的蛋白质在电场中完全按大小分离开。
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非离子去污剂：
相对温和，一般不会使蛋白质变性。只是将蛋白质分子从膜上溶解下来而已。
当[去污剂]＜其CMC值的时候，去污剂分子与膜蛋白表面的疏水区域结合，使蛋白质在水溶液中溶解而不聚集。
当[去污剂]≧其CMC值的时候，去污剂分子将与膜磷脂一起形成混合微团，膜蛋白以整合在微团中的形式存在。
一般选择非离子去污剂来保持膜蛋白生物活性
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四、蛋白分子的稳定
防止蛋白质分子可能被同时释放的蛋白质水解酶降解、Pr空间结构可能被温度或化学试剂等环境因素破坏而丧失生物学活性等。
处理：需要在缓冲液中加入蛋白酶抑制剂；
在低温下操作；
加入稳定剂(如甘油等）．
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五、细胞碎片的去除——离心( centrifugation)
原理：悬浮在溶液中的两个或多个不同质量或密度的颗粒（如细胞、细胞器、大分子复合体、或分子等）沉降到试管的底部的速度是不一样的，质
量越大、或密度越高沉降的速度越快。
沉淀：固体性的细胞碎片和细胞器沉降到离心管的
底部形成；
上清：绝大多数蛋白分子或蛋白复合体保留在细胞
抽提液中即上清中．
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六、目标蛋白质的分离、纯化
-----蛋白质的分级沉淀和层析分离
将不同蛋白质分开的性质主要包括：
分子量的大小
带电情况
水溶性
与某种物质的特异高亲和力等
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（一）蛋白质的分级沉淀
常用的方法有：
盐析法
有机溶剂法
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蛋白质的胶体性质：
蛋白质颗粒表面多为亲水基团，可吸引水分子，使颗粒表面成有一层水膜，蛋白质颗粒相互隔开，不会聚集成大颗粒而沉淀。
此外，蛋白质表面可带有电荷，可起胶粒稳定的
作用。
若去除蛋白质胶体表面电荷和水化膜两个稳定因素 ，蛋白质极易从溶液中析出
盐析法
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盐析法
概念：将中性盐加入蛋白质溶液，破坏水化膜和电荷而使蛋白质沉淀，叫盐析。各种蛋白质盐析所需的盐浓度及PH不同，加入不同浓度的中性盐可使各种蛋白质依次分别沉淀出来。
优点：操作简