文档介绍：荧光染料CM-DiI标记大鼠骨髓间充质干细胞的体外实验
陈国东 朱栋梁 覃丽 【摘要】 目的 探讨荧光染料CM-DiI标记大鼠骨髓间充质干细胞的效果及其对细胞活力、增殖能力、凋亡等生物学特性的影响。方法 用梯度离心加贴壁培养法获ty decreased roughly in parallel with the number of cell divisions and the time of CM-DiI did not affect cell viability,proliferation and CM-DiI labeling was convenient and effective,did not affect biological characteristics of MSCs,it should be a useful marker for tracking cells in short-term experiment.
【Key words】 Mesenchymal stem cells; CM-DiI; Labeling
干细胞移植是细胞治疗的重要内容,是当前再生医学研究的热点。骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是来源于骨髓的一种成体干细胞,具有自我更新和多向分化潜能,在适当条件下可分化为肝细胞样细胞、成骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞、血管内皮细胞等[1~3]。移植前对干细胞进行有效标记是移植后检测、识别移植细胞,了解移植细胞在体内存活、迁移、分布、分化、转归和判断疗效的必要前提。CM-DiI是1,1'-双十八烷-3,3,3',3'-四***吲哚羰基花青高***酸盐(1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate,DiI)的衍生物,与DiI一样是具有亲脂性的荧光染料,可对细胞进行非特异性染色。当DiI嵌入细胞膜后在549 nm激发光下,细胞可发射波长为565 nm橙红色荧光,便于荧光显微镜下观察、辨识移植细胞。DiI类染料标记细胞方法较简便、安全,可用于多种培养细胞的标记[4~6]。本文拟对CM-DiI标记MSCs的方法、效果,及其对MSCs细胞活性、增殖能力、凋亡等生物学特性的影响进行探讨,为MSCs的标记和示踪提供有用的信息。
1 资料与方法
一般资料
实验动物 4周龄SPF级雄性(sprague Dawley,SD)大鼠1只,体重约70 g,由中山大学中山医学院实验动物中心提供。
主要试剂和仪器 胎牛血清(澳大利亚PAA公司),低糖型DMEM培养基(美国GIBCO公司),Percoll细胞分离液(美国Pharmacia公司),Hoechst 33258(美国Molecular probe公司),CCK-8试剂盒(日本同仁化学研究所),CM-DiI(美国Molecular probe公司),CO2培养箱(美国Thermo公司),超净工作台(苏州净化设备厂),BECKMAN COULTER高速冷冻离心机(美国BECKMAN公司),倒置荧光相差显微镜(日本Nikon公司)。
方法
大鼠骨髓间充质干细胞的获取、培养和扩增 无菌条件下分离大鼠股骨和胫骨,用生理盐冲洗骨髓腔,获取细胞悬液,2000 rpm离心15 min,弃上清及脂肪层。生理盐水重悬, g/ml的Perco ll分离液,2000 rpm离心20 min,收集中间层的单个核细胞,生理盐水重悬,1000 rpm离心10 min,弃上清,将细胞用完全培养基(低糖DMEM,10%胎牛血清,10 ng/ml EGF)混悬,种植于100 mm塑料培养皿中,放入37 ℃,5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养。24 h后首次换液,此后每3 d换液一次,待细胞长到90%融合时,%胰蛋白酶消化液进行传代。
骨髓间充质干细胞的荧光标记 %胰蛋白酶消化,离心收集细胞后加入PBS制成细胞悬液,用计数板计数,再将细胞平均分为实验组和对照组(每组2个复孔)。实验组按1×106>/sup>细胞量加入6 μl的CM-DiI,37 ℃孵育5 min,4 ℃冰箱内置15 min,以PBS洗涤、重悬2次,加入10%DMEM培养基中置于37 ℃、5%的CO2培养箱内培养。每天用倒置荧光相差显微镜(CM-DiI的荧光激发波长为549 nm)观