文档介绍：1 EGC G 对人耐药口腔表皮样癌细胞株耐药逆转的实验作者:梁钢,林晓贞,唐安洲,黎莉,周铭【摘要】目的研究 EGCG 对人多药耐药口腔癌细胞 KBV200 的细胞毒增敏作用及裸鼠移植瘤的抑瘤作用。方法 MTT 法检测药物对细胞的毒性作用, 流式细胞术分别检测细胞P 糖蛋白的表达, HPLC 检测细胞内 VCR 浓度, 采用 KB 和 KBV200 细胞分别种植同一裸鼠左、右腋下, 观察用药后体重、抑瘤率的改变。 RT 拟 PCR 检测瘤组织 mdr1 的表达。结果 EGCG 在 100mg · L-1 以下剂量对两株肿瘤细胞的抑制率均小于 10% , EGCG 与 VCR 联合应用可明显提高 VC R 的细胞毒作用; EGC G联合 VC R 作用后 KBV20 0 细胞内 VC R 浓度升高, P 糖蛋白的表达下降; EGCG 可增加 VCR 对 KBV200 的抑瘤作用, 可降低瘤组织 MDR1 的表达量。结论 EGC G 可增强 VC R 对多药耐药肿瘤细胞 KBV20 0 的细胞毒作用,机制可能与降低 MDR1 拟 mRNA 、P拟 gp 表达,提高细胞内药物浓度有关。 2 【关键词】多药耐药; P 糖蛋白;耐药逆转剂;鳞癌 0 引言口腔癌在世界范围内高发, 居头颈部肿瘤第二位, 是十大最低患者生存率肿瘤之一,原发多药耐药(Multidrug resistance , MDR) 及继发 MDR 较为严重, 常见机制是 MDRl 、 LRP(Lungresistance related protEin,LEP) 、 MRP1(Multidrug resistance related protEIn,MRP) 表达升高,导致相应胞膜或核膜蛋白表达增高[1] 。如何解决以鳞癌、肝癌等为代表的实体瘤 MDR 问题是当前抗肿瘤研究的热点。目前 MDR 逆转剂多数为 P 糖蛋白( P拟 gp )功能抑制剂,如维拉帕米( Verapamil,VRP,Ver ) ,临床上的 VRP 最大耐受浓度为 2μ mol/L, 这一浓度在体外组织培养中不能逆转 MDR , 限制了临床的使用。到目前为止,二、三代多药耐药逆转剂( Reuersalagents,RRA ) 尚未成功应用于临床。因此在天然药物中寻找高效、低毒 RRA 或改造已知 RRA 的化学结构以降低其毒性是主要研究方向。国内外研究绿茶提取物, 特别是 EGCG 的抗肿瘤和逆转 MDR 作用,研究集中于逆转机制与 MDR1 或 MRP1 的关系, 部分结果表明 EGCG 可通过抑止 P 拟 gp 功能发挥逆转作用, 而部分资料显示其逆转作用独立于 P拟 gp和 MRP2 ,体内实验较缺乏;我们前期已证实 EGC G 3 在体外可逆转人 MD R 肝癌细胞 BEL 拟 7404/AD R的 MD R作用[1] 。本研究探讨 EGCG 体内逆转 KBV200 的 MDR 作用, 为进一步发现新的多药耐药逆转剂和可能的作用靶点提供实验依据。 1 材料和方法 细胞与动物人口腔表皮样癌细胞株KB和 KBV20 0 由北京大学临床肿瘤学院许佐良教授惠赠。 BALB/C 拟 nu/nu 裸小鼠(4~5周), 体重( 15±2)g ,雌雄各半,购自上海斯莱克实验动物公司,饲养于 SPF 条件下。 药物及试剂盐酸长春新碱( VCR ) 购于上海华联制药有限公司; EGC G 1060488A 分离得; MTT 购自 Sigma , RPMI 拟 1640 、新生牛血清购自 GIBCOBRL ;抗 P拟 gp拟 PE 抗体: Becton Dickinson ;小量组织总 RNA 快速抽提纯化试剂盒购自北京华舜; First strand cDNA synthesis kit 、 MassRulerTM DNA Ladder 购自 MBI 。 4 方法 细胞培养用含 10% 新生牛血清的 RPMI 拟 1640 培养液于 37℃、饱和湿度、 5% CO2 环境中培养 KBV200 培养液中含有 200nmol · L-1VCR 以维持耐药性,用 % 胰蛋白酶联合 % EDTA 消化传代。 耐药倍数测定( MTT 法) [2] 对数生长期细胞,制成( 2~5)× 105 ml-1 悬液,每孔 100 μl 接种于 96 孔板, 加入相应浓度的含药培养液, 参照文献[2] ,用酶联免疫检测仪检测波长 570nm 处的吸光度。细胞存活率=(实验组吸光度值/ 对照组吸光度值) × 100% 。由细胞存活率与药物浓度作图,求出 IC50 值。逆转倍数=逆转前耐药细胞 IC50/ 逆转后耐药细胞 IC50 。 MTT 试验在不同日重复 3 次。