文档介绍：关于动物肝脏提取和鉴定实验技术
第一张，共二十二张，创建于2022年，星期二
核酸的分类
DNA (脱氧核糖核酸)
主要存在于细胞核的染色体中。
核外也有少量DNA，如线粒体DNA（mtDNA），叶绿体DNA（cpDN
DNase:降解DNA
RNase：降解RNA
蛋白酶K：降解蛋白质
溶菌酶：破碎细胞
第七张，共二十二张，创建于2022年，星期二
核酸提取的主要步骤
沉淀核酸，去除盐类，有机溶剂等杂质
除去与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子：酚/***仿抽提、蛋白变性剂（SDS、异硫***酸胍等）、蛋白酶处理、高盐洗涤
除去其它不需要的核酸分子
破碎细胞：研磨、组织匀浆、超声、冻融；异硫***酸胍、碱裂解；酶解（溶菌酶）
第八张，共二十二张，创建于2022年，星期二
注意事项
加入RNA降解酶除RNA
加入DNA酶抑制剂：柠檬酸、***化物、***酸盐、EDTA、SDS、苯酚等
蛋白变性剂反应不宜过于剧烈
避免过酸、过碱及高温
第九张，共二十二张，创建于2022年，星期二
一、实验目的：
1、学****并掌握用浓盐法从动物组织中的提取DNA方法及其原理。
2、学****和掌握二苯***法测定DNA的原理和方法。
第十张，共二十二张，创建于2022年，星期二
二、实验原理
核酸在真核细胞中都是以与蛋白质结合的状态存在，用DNP和RNP表示。
DNA-Pro（DNP）
细胞核
RNA-Pro(RNP)
核仁及细胞质
溶于高盐溶液（1mol/L）,
微溶于低盐溶液（）
溶于低盐溶液（）
微溶于高盐溶液（1mol/L）
第十一张，共二十二张，创建于2022年，星期二
核酸含量的测定方法：紫外吸收法、定磷法和分别针对DNA和RNA的颜色反应方法。
脱氧核糖核酸中的脱氧核糖在酸性环境中变成ω-羟基-γ-***基戊醛与二苯***试剂一起加热产生蓝色化合物，在595nm处有最大的吸收 。
DNA20~400微克范围内，光密度与DNA的浓度成正比，在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应的灵敏度。
第十二张，共二十二张，创建于2022年，星期二
三、实验试剂
95%冷乙醇、NaCl固体
二苯***：称取纯二苯***1g溶于100ml冰醋酸中，加入10ml过***酸，混匀。%乙醛溶液，所配置试剂应为无色。
／L NaCl－／L 柠檬酸钠缓冲液(PH=)
DNA标准液200ug/ml:DNA钠盐用5mmol/L的NaOH配制。
***仿/异戊醇=20：1（V/V）
5% SDS
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组织捣碎匀浆机
第十四张，共二十二张，创建于2022年，星期二
猪肝8g
匀 浆
／L NaCl－／L 柠檬酸钠缓冲液
离心，4000r/min ,10min
上清（弃掉）
沉淀
沉淀
25ml缓冲液洗涤
离心，4000r/min ,20min
上清（弃掉）
／L NaCl－／L 柠檬酸钠缓冲液
沉淀
21ml***仿/异戊醇
4ml 5% SDS
振荡 30 min（保鲜膜封口）
固体，终浓度为1mol/L
离心，3500r/min ,20min
吸取上清（量取体积）
95%冷乙醇（缓慢加入）边加边朝一个方向缓慢搅动
DNA粗制品
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第十六张，共二十二张，创建于2022年，星期二
除去蛋白质的方法
SDS（十二烷基硫酸钠）等去污剂使蛋白质变性，可以直接从生物材料中提取DNA
防止DNA酶的降解，提取时可加入适量EDTA（乙二***四乙酸）、柠檬酸，以降低DNA酶的活性
***仿一异成醇使蛋白质变性，离心除去变性蛋白质
第十七张，共二十二张，创建于2022年，星期二
DNA的定量测定
第十八张，共二十二张，创建于2022年，星期二
DNA粗品用5mmol/LNaOH溶解并定容至50ml，作为待测品。
混匀，60℃水浴保温45min，冷却后，595nm处，比色。
第十九张，共二十二张，创建于2022年，星期二
以吸光度A595nm对DNA含量（ug）作图，
绘制标准曲线。
从标准曲线上查出样品的DNA含量。
计算100g猪肝中DNA的含量：
待测样品中D