文档介绍：1 重组人胸腺素α1 基因在黄芪毛状根中的表达作者:范伟全包晓群韩树海刘永刚张宏桂【摘要】目的利用黄芪毛状根表达人胸腺素α1。方法合***胸腺素α1 基因,构建重组载体 pCAMBIA1301 拟 hT α1 ,以黄芪下胚轴为外植体,通过发根农杆菌 C58C 1 介导转入黄芪毛状根中, 取潮霉素抗性毛状根用 PCR 法检测人胸腺素α1 基因的整合, SDS 拟 PAGE 、 Western 印迹法分析人胸腺素α1 基因的表达。结果潮霉素抗性毛状根整合并表达了人胸腺素α1 基因。结论重组人胸腺素α1 基因在黄芪毛状根中能够表达, 为以黄芪毛状根为生物反应器工业化生产人胸腺素α1 提供了实验基础。【关键词】人胸腺素α1 ;黄芪毛状根;发根农杆菌;重组载体人胸腺素α 1(human thymosin alpha1 , hT α 1) 是一种强力的免疫增强剂, 主要用于自身免疫性肝病、原发性免疫缺陷、 2 慢性乙型肝炎、丙型肝炎、黑素瘤、艾滋病及某些癌症(乳腺癌、肺癌、肝癌、胃肠道肿瘤、恶性黑色素瘤、何杰金氏淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、肾癌等) 、男性不育症、动脉粥样硬化等免疫缺陷病、免疫抑制性疾病及病毒病和肿瘤的治疗, 具有良好的临床疗效〔1,2〕。本研究首先构建植物双元表达载体 pCAMBIA1301 拟 hT α1 ,然后通过发根农杆菌 C58C1 介导转入黄芪毛状根中, 最终在黄芪毛状根中表达人胸腺素α1 ,从而建立以毛状根作为生物反应器生产 hT α1的方法。 1 材料与方法 材料黄芪种子由中国草地研究所提供;发根农杆菌 C58C1 和质粒 pCAMBIA1301 载体由东北林业大学生命科学院惠赠; PCR 引物由上海生工生物工程有限公司合成, 限制性内切酶和连接酶购自大连宝生物公司, Western 印迹法分析和其他试剂均购自北京鼎国生物技术公司。 方法 3 载体 pCAMBIA1301 拟 hT α1 的构建合成带碱性磷酸酶信号肽的 hT α1 基因片段, 5′端引入 Nco I 位点, 3′端引入 Bstb I 位点。摇菌提质粒后用 Nco I和 Bstb I 酶切, 回收目的片段后连接至 pCAMBIA1301 载体上。转化 感受态,提取质粒用 Nco I和 Bstb I 酶切,切下 150 bp 片段,鉴定载体构建的正确性。 制备工程菌制备发根农杆菌 C58C1 感受态细胞,用载体 pCAMBIA1301 拟 hT α1 转化感受态细胞, 涂板( Rif 50 mg/L , Km 100 mg/L , Sp 100 mg/L ), 37℃倒置培养 12~ 16h, 挑取单个菌落, 提取质粒, 1% 琼脂糖凝胶电泳鉴定后冻存菌种备用。 转化黄芪毛状根 培养黄芪无菌苗清洗黄芪种子 2 次,在 70% 乙醇中浸泡 1 min ,用无菌水冲洗3次, 然后用 % 升***( HgCl2 ) 进行表面消毒8 min 4 后, 用无菌水浸洗 5次, 每次 2 min 。接种在不含激素的 MS (蔗糖 3% ,琼脂 % , )培养基上进行无菌萌发,置于(25 ± 1)℃植物气候培养箱中, 4~7d 后萌发长出无菌苗。 培养工程菌将发根农杆菌在