文档介绍：关于基因敲除小鼠的构建
第1页，讲稿共15张，创作于星期日

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关于基因敲除小鼠的构建
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基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。
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同源重组法
插入突变法
RNAi法
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利用同源重组构建基因敲除小鼠的基本步骤
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1）基因载体的构建

把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子都重组到带有标记基因的载体上，成为重组载体。
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2）ES 细胞的获得：

现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞，最常用的是鼠，而兔，猪，鸡等的胚胎干细胞也有使用。
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3）同源重组：

将重组载体通过一定的方式导入同源的胚胎干细胞(ES cell)中，使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的DNA序列整合到内源基因组中，从而得以表达
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4）选择筛选已击中的细胞：

目前常用的方法是正负筛选法（PNS法），标记基因的特异位点表达法以及PCR法。其中应用最多的是PNS法。
5）表型研究：

通过观察嵌和体小鼠的生物学形状的变化进而了解目的基因变化前后对小鼠的生物学形状的改变，达到研究目的基因的目的。
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6）得到纯合体：

由于同源重组常常发生在一对染色体上中一条染色体中,所以如果要得到稳定遗传的纯合体基因敲除模型，需要进行至少两代遗传。
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该方法通过同源重组将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点，以达到定点修饰改造染色体上某一基因的目的，克服了随机整合的盲目性和偶然性，是一种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法。
直到现在，运用基因同源重组进行基因敲除是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。
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此法利用某些能随机插入基因序列的病毒，细菌或其他基因载体，在目标细胞基因组中进行随机插入突变，建立一个携带随机插入突变的细胞库，然后通过相应的标记进行筛选获得相应的基因敲除细胞。
基因捕获法是最近发展起来的利用随机插入突变进行基因敲除的新型方法。
技术原理：
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RNAi引起的基因敲除
RNAi基因敲除的优点及应用
比用同源重组法更加简便，周期大大缩短。
对于哺乳动物，如对于一些敲除后小鼠在胚胎时就会死亡的基因，可以在体外培养的细胞中利用RNAi技术研究它的功能。
RNAi还被用来研究在发育过程中起作用的基因，如可用RNAi来阻断某些基因的表达，来研究他们是否在胚胎干细胞的增殖和分化过程中其起着关键作用。
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建立生物模型
提供廉价的异种移植器官
疾病的分子机理研究和疾病的基因治疗

免疫学中的应用

改造生物、培育新的生物品种
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