文档介绍：关于多克隆抗体的制备 (2)
第1页，讲稿共38张，创作于星期日
主要内容
多克隆抗体制备的基本原理
多克隆抗体制备的操作步骤
抗体活性的实验原理、操作流程和结果判断
第2页，讲稿共38张，创作于星期日
原 理
后者由弗氏不完全佐剂加卡介苗组成。在免疫动物时，先将弗氏佐剂与抗原等比混匀，制成“油包水”乳化液。
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佐剂与抗原混合乳化的方法：
研磨法
搅拌混合法
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佐剂的免疫生物学作用
增强抗原免疫原性：使无或微弱免疫原性的物质变成持久或强的免疫原；
增强机体对抗原刺激的反应性，提高初次应答和再次应答所产生的抗体滴度；
改变抗体类型，使产生抗体由IgM型转变为IgG型；
引起或增强迟发性超敏反应。
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佐剂的作用机制
佐剂的作用机制归纳起来主要有如下几种：
可增强抗原的表面积和改变抗原活性基团构型，从而增强 抗原的免疫原性。
佐剂与抗原混合一起注入机体，可改变抗原的物理性状，形成抗原储存库，延长抗原在局部组织的滞留时间，有利于抗原的缓慢释放。
增强吞噬细胞的吞噬作用（被佐剂吸附的抗原易被吞噬细胞吞噬），促进对抗原的处理，刺激淋巴细胞增生，从而增强和扩大免疫应答的效应。
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动物免疫
免疫动物的选择：
抗原来源与动物种属的关系：抗原的来源与免疫动物种属差异越远，其免疫源性越强，免疫效果越好，而同种系或亲缘关系越近，免疫效果越差。
动物个体的选择：适龄、健康、体重符合要求的正常动物（以雄性为佳）；抗体需要量少时，选用家兔、豚鼠和鸡等小动物；抗体需要量大时，可选用绵羊、山羊、马、驴等大动物。
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免疫方法
选定动物后，在免疫过程中应考虑免疫剂量、免疫途径、免疫次数、免疫间隔等因素。
免疫原的剂量：免疫原的接种剂量按免疫原性的强弱、动物的个体状态和免疫时间来确定。首次免疫时，剂量不宜过大，以免产生免疫麻痹。
免疫途径通常有皮内、皮下、肌肉、静脉、腹腔、淋巴 结等，视不同的免疫方案而异。对于不易获取的宝贵抗原可采用淋巴结免疫法。
免疫间隔时间是影响抗体产生的重要因素，其中首次与第二次免疫的间隔时间尤为重要，一般以10～20天为佳，二次后间隔时间一般为7～10天，若间隔时间太长，则刺激减弱，抗体效价不高。
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动物采血
采集免疫血清前，要预先测试抗体效价测定，若效价达到要求，应在末次免疫后一周及时采血，否则抗体效价会下降。
颈动脉采血法
心脏采血法
静脉采血法
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免疫血清的鉴定
表达量的测定：颗粒性抗原可采用凝集试验，可溶性抗原常用双向免疫扩散试验、ELISA等方法。
玻片凝集试验
肥达试验（微量法）
ELISA
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玻片凝集试验
玻片凝集试验为定性试验方法，一般用已知抗体作为诊断血清、与受检颗粒抗原如菌液或红细胞悬液各加1滴在玻片上，混匀，数分钟后即可用肉眼观察凝集结果，出现颗粒凝集的为阳性反应。
此法简便、快速，一般用来鉴定菌种或分型，也用于人类ABO血型的鉴定。
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肥达试验（Widal test）是用已知的伤寒杆菌O、H抗原和甲、乙型副伤寒杆菌H抗原与病人血清做定量凝集试验，以测定患者血清中有无相应抗体，根据抗体含量的多少以及增长情况判断阳性。
此法一般用来帮助诊断伤寒及副伤寒。
肥达试验
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ELISA
酶联免疫吸附实验(ELISA) 即将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行的技术。
该技术可用于检测大分子抗原和特异性抗体等，具有快速、灵敏、简便、载体易于标准化等优点。
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特异性鉴定：抗体特异性鉴定常用双向免疫扩散法、免疫电泳法。
纯度鉴定：
抗体纯度的鉴定可采用SDS-聚丙酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、双向扩散试验、免疫电泳等方法。
IgG含有重链和轻链，纯IgG的SDS-PAGE结果应有两条蛋白电泳带（分子量约53kD和22kD），若出现多条电泳带则表明制备的抗体混有杂蛋白，需进一步纯化。
结合活性鉴定：测定抗体亲力的方法较多，如平衡透析法、ELISA或R