文档介绍：集团文件发布号：（9816-UATWW-MWUB-WUNN-INNUL-DQQTY-19882）
真菌检测方法
分离培养：无菌采取病料接种马铃薯琼脂培养基中，置37℃中培养24小时，长成绒毛样菌丝，未见其它细菌生必须特别注意的是,有几类生长特别快、菌丝很多的菌
,则必需在48小时以内计数,否则菌丝就会覆盖整个平皿,无法准确计数。这类菌主要有:毛霉、根霉、犁头霉、共头霉、木霉等湿度较大的样品,这类菌污染较多,检测这类样品,应提早观察记录。
5 最适计数范围
霉菌菌落由孢子和菌丝组成,相当扩散,在直径9cm的平皿里,菌落数稍多就相互交叉重叠,影响计数,但数量太少又会产生较大的误差,因此选择适当的稀释度计数是保证结果准确的关键环节之一。我们对这方面作了一些观察研究,首先是将实验菌株的斜面培养物制成含有约106个/ml的孢子悬液,并用血球计数器在显微镜下准确计数,然后将饱子悬液作10-1~10-6倍稀释,吸取不同稀释度的稀释液接种于PDA,25℃培养5天后计数。30种常见霉菌的两种不同计数方法所得结果比较显示,大部分菌株每平板含有10~50个菌落的稀释度时的计数与显微镜计数结果最接近;有近一半的菌株,每个平板含50~100个菌落已较难计数,而大部分菌株,超过100个/平皿或小于10个/平皿的计数结果就与显微计数结果存在较大差别,因此,应尽量选择10~50个/平皿的稀释度进行霉菌计数。而对上述提及的菌丝很丰富、菌落特别扩散的毛霉、根霉、犁头霉等菌株,则应在更少的范围内计数(30个/平皿以内)。为控制霉菌的生长速度和菌落的生长范围,可在培养基中添加少量抗生素,如***霉素(50~100mg/L),金霉素(20~100mg/L),庆大霉素(50mg/L),土霉素(100mg/L)等。
6 霉菌检测过程中应特别注意的事项
由于霉菌检测所需的时间较长,中间又需要多次观察,因此实验前一定要作好实验计划,明确观察记录的时间。
霉菌孢子通过空气传播,所以实验时应保持实验室平静,减少空气流通;操作时手脚要快,动作要轻,特别是培养过程中,如果观察时动作过大,早期生长出的霉菌孢子就会在培养基内扩散,形成新的菌落,导致结果不准确。
实验前应认真做好全面的消毒工作,包括操作人员手指、实验室空间、实验台等,实验后应第一时间将有霉菌的培养物高压灭菌,防止进一步扩散。
对使用的菌株的生理、生态、形态、毒理、致病性必需有充分的了解,并作好相应的防扩措施,防止污染其它物品。
涂片镜检分别取l5 羽鸡肺部或气囊有结节
的病料，将结节用2 片载玻片压碎后分开，再用镊子
调匀，革兰氏染色后盖上盖玻片，置高倍镜下观察。
结果在暗视野下可见到大量的分隔菌丝， 气囊上的
结节除可见到菌丝外， 还可以见到散在的蓝色球状
孢子。
分离培养挑取典型病变结节接种于血液琼
脂平板培养基上，置于37 ℃温箱中培养。24 h 后可
见到小米粒大小的白色绒毛状菌落，48 h 后菌落增
大，60 h 后转为淡绿色，72 h 后菌落转为暗绿色，一
个星期后呈黑褐色[4]。用接种环挑取菌落涂片镜检，
可见到曲霉菌的形态结构（菌丝有隔，末端膨大成球
状，球上有小梗，有的梗上有孢子存在，状如花冠），
符合曲霉菌的特点。
根据实验室检查结果再结合病史调查、现场观
察、临床症状及剖检变化，可确诊为禽曲霉菌病。
（一）直接检查 是最简单而重要方法，浅部感染真菌的病变标本如毛发、皮屑、甲屑置玻片上，滴加10%KOH，覆盖玻片微热熔化角质层，再将玻片压紧，用吸水纸吸去周围多余碱液，在显微镜下观察，见皮屑甲屑中有菌丝，或毛发内部或外部有成串孢子，即可初步诊断为癣菌感染，但不能确定菌种。深部感染真菌标本如痰，脑脊液亦可做涂片用革兰氏染色（白色念珠菌）或愚汁负染色（隐球菌）观察形态特征。 （二）培养检查 本法可确定菌种，辅助直接检查不足，通常用沙保氏培养基（22～28℃），深部真菌可用血琼脂或脑心葡萄糖血琼脂37℃培养，或根据不同菌种运用不同培养基，如孢子丝菌可用胱氨酸血液葡萄糖琼脂，必要时运用鉴别培养基和生化反应，同化试验等进行鉴定。 （三）免疫学试验 近年来有许多方法用于检测深部感染真菌的抗体，作辅助诊断荚膜组织胞浆菌、念珠菌、曲霉菌。但系统性感染患者常因免疫功能降低不出现抗体；而且许多真菌间抗原性有交叉反应；有的产生抗体后维护时间较长，正常人群中有一定比例的阳性率，则必须结
合临床情况分析结果才能作出恰当的诊断。 由于上述检测抗体受到许多因素的限制，及深部真菌感染时，早期培养阳性率甚低，晚期则多于失去治疗时机，因此用免疫学方法从血清或其他部位检测真菌抗原，对早期诊断具有