根癌农杆菌介导的真菌转化.doc

文档介绍：根癌农杆菌介导的真菌转化
(一) 农杆菌电击感受态制备及电击转化
A 感受态的制备
1) 将农杆菌菌液划线于YEB平板(50 µg/ml kana),28℃,36-48h。
2) 挑单菌落至3ml YEB试管(50 µg/ml kana)中,28℃,200rpm 培养过夜。
3) 转1ml至50ml YEB中,28℃,200rpm培养至OD600=。
4) 于4℃,5000rpm,10min收集菌体。
5) 用50mL 10%的甘油(去离子水配置,湿热灭菌)洗沉淀3次(4℃,5000rpm,10min),洗涤时一定要把菌体悬浮均匀。
6) 重悬于1ml 10%甘油中(约1011个细胞/ml),可立即使用,或分装为每管50µl,液氮速冻后,-80℃保存备用。
B 电击转化
1) 将1µl质粒加入到农杆菌感受态细胞中,混匀,转至无菌预冷的电击杯中。
2) 将电击杯放入电转化仪的电极之间,16kv/cm,5ms。
3) 取出电击杯,迅速加入200-300µl YEB(不加抗生素),并将混合液转入EP管中。
4) 于28℃,220rpm,2-3h。
5) 将50-100µl菌液涂布于YEB平板(50µg/ml car和50 µg/ml kana)上,于28℃培养2-3天后,挑斑鉴定。
(二) 农杆菌化学感受态制备及化学法转化
A . Competent Cells
Inoculate a single colony to 5 ml LB
Grow at 28℃ to log phage,shaking at 250rpm
Inoculate 2ml of the culture to 50 ml LB medium and grow to OD600= ca. 8 hours
Chill on ice for 10 minutes
Spin down the cells by centrifugation at 3000g(8000rpm) for 10 minutes at 4℃
Resuspend cells in 1 ml of 20 mM CaCl2
Aliquots into ml ,then freeze in liquid nitrogen , and store at -80 ℃
B Plasmid Transformation
petent cells on ice.
Add 1 µg plasmid (5µl) to petent cells and mix well.
Freeze in liquid nitrogen for 5 min.
Heatshock at 37℃ for 5 min.
Add 1 ml LB and grow at 28℃ for 3 hr with shaking at 150 rpm.
Spread cells onto LB plates containing an appropriate antibiotic and incubate at room temperature for 2-3 days.
(三)农杆菌介导的真菌转化
1 将已转入目的质粒的农杆菌接种于4mlYEB液体培养基(50µg/ml car和50 µ